白毛藤對人乳腺癌MCF-7細胞凋亡的影響△

楊旭東，張杰，楊驕霞

（1.黑龍江省牡丹江醫學院，黑龍江 牡丹江 157011；2.黑龍江省牡丹江醫學院附屬紅旗醫院，黑龍江 牡丹江 157011）

白毛藤對人乳腺癌MCF-7細胞凋亡的影響△

楊旭東1*，張杰1，楊驕霞2

（1.黑龍江省牡丹江醫學院，黑龍江 牡丹江 157011；2.黑龍江省牡丹江醫學院附屬紅旗醫院，黑龍江 牡丹江 157011）

目的：探討Bcl-xl、p53基因在白毛藤誘導人乳腺癌MCF-7細胞凋亡中的作用。方法：不同濃度白毛藤作用于MCF-7細胞48h后，熒光顯微鏡觀察人乳腺癌細胞MCF-7細胞凋亡情況，RT-PCR法檢測Bcl-xl、p53基因表達量的變化。結果：白毛藤能誘導MCF-7細胞凋亡，并且上調p53和降低Bcl-xl表達。結論：白毛藤抑制人乳腺癌MCF-7細胞細胞增殖，促進凋亡，其機制可能與激活p53、抑制Bcl-xl表達有關。

白毛藤；乳腺癌；細胞凋亡

乳腺癌是全球第二高發的惡性腫瘤，為女性發病率最高的癌癥。我國近年來乳腺癌發病率也呈現快速上升趨勢。目前臨床上治療手段是以手術和化療為主。化療在乳腺癌治療中占有很重要的地位，但仍存在一定的不良反應和多藥耐藥性。隨著醫學水平的不斷提高，中藥已經成為當今治療腫瘤的重要手段，其優勢在于中藥不僅對腫瘤具有抑制作用，不易產生耐藥性，而且對機體的損傷和副作用也較小，因而研究中藥抗腫瘤作用及其分子機制是我國科學工作者的重要課題之一。白毛藤Solamum lyratumThunb系茄科植物白英的全草，具有清熱利濕、消腫解毒的功效［1］。白毛藤作為抗癌中藥之一，臨床上用于胃癌、肝癌等多種腫瘤的治療，已有研究表明，白毛藤水提物體外有較強的腫瘤細胞增殖抑制活性［2］，但對其抗癌作用機理闡述并不明確。本研究的目的在于觀察白毛藤誘導人乳腺癌MCF-7細胞凋亡作用，初步探討其作用機制，為白毛藤應用于乳腺癌的臨床治療提供一些新的實驗依據。

1 材料

1.1 細胞株

人乳腺癌MCF-7細胞細胞株（武漢中美科技有限公司）。

1.2 藥物、試劑與儀器

白毛藤全草（購自牡丹江保健大藥房），經牡丹江醫學院醫學與藥物研究中心袁曉環教授鑒定；MTT試劑（泰倫生物科技有限公司，批號041025）；Trizol（Sigma公司，批號15596-018）；引物核苷酸片段（上海生工生物技術有限公司）。熒光顯微鏡（CKX41-F32FL，奧林巴斯）。

1.3 藥物處理

白毛藤全草干品20g，粉碎，用400mL雙蒸水浸泡30min，加熱沸騰60min，倒出液體留用，藥渣加200mL雙蒸水再煮1次，合并兩次煮出液，使其自然冷卻，100目篩絹過濾，棄藥渣。濾液經15 000 r·min－1，4℃離心20min，上清液用冷凍干燥機冷凍干燥，將干燥物溶解于40mL PBS，0.22μm除菌濾器過濾除菌，得0.5g·mL－1的棕褐色澄清透明溶液，避光冷藏，實驗時再稀釋為所需要的藥物終濃度。

2 方法

2.1 細胞培養與分組

人乳腺癌細胞MCF-7在含10%胎牛血清的DMEM中采用開放式單層貼壁培養，培養條件為37℃，5%CO2，飽和濕度，待細胞生長至80%濃度時，0.25%胰酶消化，每3d更換1次培養液。加受試物前7d將細胞用PBS洗滌后改為含10%去雌激素胎牛血清的無酚紅DMEM中培養，以耗盡細胞內儲存的雌激素。實驗組：用培養液倍比稀釋的濃度為4，6，8，16mg·mL－1的白毛藤水提液。對照組：用含MCF-7細胞的培養液。

2.2 細胞凋亡檢測

取指數生長期的癌細胞，加入適量0.25%胰蛋白酶液消化細胞，使貼壁細胞脫落。用含10%胎牛血清的培養基制備成濃度為3×105·mL－1的細胞懸液，于6孔板中每孔接種1mL。將普通潔凈蓋玻片置于37℃、5%CO2培養箱。24h后加入不同濃度的白毛藤；對照組加相同體積的培養液。48h后細胞用胰酶消化，冷PBS（pH7.2）洗3遍，固定液甲醇-冰醋酸（3∶1），4℃固定10min，棄固定液，蒸餾水洗3遍，室溫干燥，用5mg·L－1Hoechst33258染色，37℃、5%CO2培養箱中孵育15min，將孔中的蓋玻片取出，蓋在已滴好甘油的載玻片上，置于熒光顯微鏡上觀察細胞形態并拍照。

2.3 DNA裂解片段分析（DNA ladder）

取指數生長期癌細胞3×105個，加入不同濃度的白毛藤，作用72h后，收集細胞、洗滌，加裂解液50μL，50℃水浴1h；加RNA酶A（10g·L－1）10μL，50℃水浴2h；加2mol·L－1NaCl 60μL，震蕩后10 000r·min－1離心5min；取上清置于新的Eppendorf管中，加2.5倍體積的95%乙醇于－20℃沉淀過夜；次日10 000r·min－1離心10min，去上清液，室溫晾干，加TE液10μL溶解；2%瓊脂糖凝膠40 V電泳，凝膠掃描成像系統鑒定并照相。

2.4 RT-PCR測定Bcl-xl、p53表達

提取腫瘤細胞總RNA，用RT-PCR方法檢測腫瘤細胞Bcl-xl、p53基因表達。設計引物如下：bcl-xl引物，上游：5′-CCCAGAAAGGATACAGCTGG-3′；下游：5′-GCGATCCGACTCACCAATAC-3′，擴增片段448bp。p53引物，上游：5′-TTCTCTCCCCAACAATGAGG-3′；下游：5′-TCTGTGAAGCAGCACCATTC23′，擴增片段531bp。β-actin上游引物：5′-ATGTGGCACCACACCTTCTA-3′，下游：5′-CGTCATACTCCTGCTTGCTG-3′，擴增片段838bp。反應條件：94℃預變性5min；變性30s（94℃），退火30s（58℃），延伸1min（72℃），共30個循環，最后72℃延伸7min。經凝膠成像系統分析，分別計算bcl-xl、p53與內參擴增帶熒光強度×面積的比值，得出bcl-xl、p53 mRNA的相對表達量。

2.5 統計學分析

3 結果

3.1 熒光顯微鏡檢測細胞凋亡情況

熒光顯微鏡觀察不同濃度白毛藤作用48h后，可見藍色深染的凋亡細胞，并可見細胞核碎裂，細胞體積縮小。實驗組與對照組比較有顯著性差異（P＜0.01），結果見表1。

表1 各組細胞凋亡率（±s）

表1 各組細胞凋亡率（±s）

注：與對照組比較，**P＜0.01，*P＜0.05

對照組3.41±2.12實驗組2 14.64±5.62*4 16.17±8.04**8 20.54±9.02**16 23.42±9.89**

3.2 各組DNA ladder結果

對照組細胞DNA沒有片段化，而2，4mg·mL－1白毛藤組細胞72h基因組DNA開始降解，出現模糊的梯狀條帶，8，16mg·mL－1白毛藤組72 h后基本形成典型的梯狀條帶，結果見圖1。

圖1 各組細胞DNA ladder情況

3.3 各組Bc1-xl和p53基因表達情況

與對照組相比，不同濃度白毛藤作用48h后，腫瘤細胞中原癌基因bcl-xl基因表達逐漸降低，抑癌基因p53基因表達逐漸增加，16mg·mL－1組最明顯，見圖2～3、表2。

圖2 各組細胞bcl-xl基因表達

圖3 各組細胞p53基因表達

表2 各組Bc1-xl和p53表達情況（±s）

表2 各組Bc1-xl和p53表達情況（±s）

注：與對照組比較，**P＜0.01，*P＜0.05

-Actin對照組組別劑量／mg·mL－1 Bcl-xl／β-Actin p53／β 0.91±0.05 0.23±0.01實驗組2 0.68±0.05*0.31±0.02*4 0.59±0.04**0.43±0.04**8 0.36±0.02**0.64±0.05**16 0.21±0.01**0.75±0.06**

4 討論

細胞凋亡又稱為程序性細胞死亡（Programed cell death，PCD），是在精密調節下的細胞的主動死亡過程，在個體發育生長過程中起重要作用。細胞凋亡的異常與多種病理生理過程相關，如腫瘤的發生發展、動脈粥樣硬化、自身免疫疾病等。bcl基因家族是重要的凋亡調控基因，包括抑凋亡基因bcl-2、bcl-xl和促凋亡基因如bax、bak、bcl-xs等［3］。bcl-xl過表達與腫瘤發生有密切關系，并能抑制化療等引起的凋亡，而下調其表達則能促進凋亡發生［4］。p53基因為抑癌基因，存在于正常細胞核中，對細胞損傷分化有抑制作用，具有促進細胞凋亡的作用［5］。p53編碼多功能的抑癌蛋白p53，主要功能是在檢測基因組損傷、啟動修復損傷基因組從而維持基因組穩定，在抑制或阻止細胞轉化、誘導基因組損傷的細胞凋亡等方面起到決定性作用，從而抑制腫瘤的發生、去除衰老細胞等［6］。

本研究結果顯示，白毛藤促進乳腺癌細胞凋亡，濃度越大，作用越明顯。白毛藤可以明顯上調乳腺癌細胞p53基因mRNA表達，降低bcl-xl基因mRNA表達。實驗結果提示，白毛藤誘導乳腺癌細胞凋亡的分子機制可能與調控Bcl-xl和p53基因表達有關。

［1］馮洪錢.民間獸醫本草［M］.北京：科學技術文獻出版社，1993：307-308.

［2］施文榮，劉艷.白英對人急性早幼粒白血病HL60細胞生長的影響［J］.福建中醫學院學報，2002，12（1）：36-38.

［3］Nicholson DW，Thomberry NA.Apoptosis：Life and death decision［J］.Science，2003，299：214-215.

［4］Pena JC，Thompson CB，RecantW，etal.Bcl-xl and bcl-2 expression in squamous cell carcinoma of the head and neck［J］.Cancer，1999，85：164-170.

［5］Tordan J，Galmdo M F，Piehn JH，etal.P53 expression induces apoptosis in hippoocampal Pyramidal neuron cultures［J］.JNeurosci，1997，17：1397-1405.

［6］RILEY T，SONTAGE，CHEN P，etal.Transcriptional control of human p53-regulated genes［J］.Nat Rev Mol Cell Biol，2008，9（5）：402-412.

Effect of Solanum Lyratum Thunb on the Apoptosis of MCF-7 Human Breast Cancer Cells

Yang Xudong，Zhang jie，Yang Jiaoxia
（1.Mudanjiang Medical College，Mudanjiang Heilongjiang157011，China；2.HongQi Hospital Affiliated to Mudanjiang Medical College，Mudanjiang Heilongjiang157011；China）

Objective：To investigate the effect of Bcl-xl and p53 gene on Human breast cancer MCF-7 cells.MethodsHuman breast cancer MCF-7 cellswere treated with various ofSolanum lyratumThunb，We observed cell apoptosis of MCF-7 cells by fluorescencemicroscope.We detected the levels of Bcl-xl and p53 gene expression in all groups by RT-PCR.ResultsSolanum lyratumThunb has obviously apoptosis-inducing effects on Human breast cancer MCF-7 cells and could effectively decrease the level of Bcl-xl gene expression and recrease the level of Bcl-xl gene expression.ConclusionSolanum lyratumThunb could induce apoptosis of MCF-7 cells probably by regulating Bcl-xl gene expression and regulating p53 gene expression.

Solanum lyratumThunb；Breast cancer；Apoptosis

黑龍江省教育廳科學技術研究項目——白毛藤有效成分誘導腫瘤細胞凋亡的機制研究（11531398）

*楊旭東，Email：xingzhe01mdj＠126.com

2009-11-23）