蕓豆蛋白淀粉樣纖維聚集后屬性的變化研究

張業輝，黃利華，溫其標，唐傳核，*

（1.廣東省農業科學院農業生物技術研究所，510610；2.華南理工大學輕工與食品學院，廣東廣州510640；3.廣州城市職業學院建筑環境與食品工程學院，廣東廣州510405）

蕓豆蛋白淀粉樣纖維聚集后屬性的變化研究

張業輝1，2，黃利華3，溫其標2，唐傳核2，*

（1.廣東省農業科學院農業生物技術研究所，510610；2.華南理工大學輕工與食品學院，廣東廣州510640；3.廣州城市職業學院建筑環境與食品工程學院，廣東廣州510405）

研究探討了蕓豆蛋白的淀粉樣纖維聚集后的溶液和形成凝膠屬性的變化。一定濃度的蛋白質溶液在低pH和低離子強度的條件下，加熱可以形成線性聚集。蛋白質分子熱聚集，導致了溶液和形成的凝膠性質上發生了較大的改變。淀粉樣纖維蛋白質的形成可以通過剛果紅的波長掃描來確定，流變儀測定蛋白溶液的粘度和形成凝膠的強度，掃描電鏡觀察蛋白質構象變化后的微觀形態。

蕓豆蛋白，加熱聚集，淀粉樣纖維，性質變化

蕓豆（Phaseolus vulgaris）又名腰豆，是一種營養豐富且廣泛種植的食用性豆類作物，據測定蕓豆中蛋白質含量23g/100g左右。蕓豆蛋白與大豆蛋白相比具有更加優良的功能性質，如相同條件下的蕓豆蛋白比大豆蛋白具有更好的乳化性和凝膠性［1-2］。在研究開發食品新特性和功能的時候，通常可以通過改變原料的結構和性質達到目的。目前，富含蛋白的食品顯現出受消費者青睞的趨勢，這類產品的種類和數量也日益增多，而蕓豆可作為糧豆配合開發新營養主食品種的原料［3］。蛋白質的熱凝膠也越來越多地被應用于食品加工中。影響蛋白質形成淀粉樣纖維的因素主要有加熱的溫度、溶液的pH、離子強度等。蛋白質淀粉樣纖維是較高程度的各向異性的蛋白聚集，在一定條件下蛋白聚集的長度大約有幾個微米，直徑因蛋白的差異而有所不同。蛋白質淀粉樣纖維可在低pH和高于變性溫度條件下加熱一定時間獲得。Luben N A等人［4］在研究了β-乳球蛋白在低pH的條件下持續加熱，蛋白質水解為縮氨酸，部分的縮氨酸存在于蛋白質淀粉樣纖維中，并且淀粉樣纖維可以極大提高地原蛋白液的粘度。因此，研究蛋白質淀粉樣纖維如何改變蛋白質溶液和凝膠的結構屬性有較強的現實作用和意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蕓豆 廣州好又多超市購得的優質蕓豆；剛果紅 分析純，Sigma；其它試劑 均為國產分析純。

過濾膜 Millipore；離心機 HITACHI；分光光度計 F-4500，HITACHI；流變儀 RS-600，HAAKE；掃描電鏡 XL-30，PHILIPS。

1.2 實驗方法

1.2.1 蕓豆分離蛋白的制備 蕓豆分離蛋白的制備參考EI-Hady等人［5］的制備蛋白的方法，并且稍加改變。紅蕓豆在4℃的NaHCO3溶液中浸泡15h，人工脫去蕓豆外皮，將蕓豆種子放入凍干機凍干。將凍干的豆子粉碎，使用正己烷將豆粉脫脂三次，將脫脂的豆粉溶解在蒸餾水中，攪拌均勻后，用2mol/L NaOH調pH至8。將蛋白溶液離心后的上清液用2mol/L HCl調pH至4.5。在相同的條件下再次離心，將離心后沉淀溶解后調pH至7，最后經過透析，冷凍干燥后即得蕓豆分離蛋白。

表1 蕓豆蛋白溶液的表觀現象和性質參數

1.2.2 淀粉樣纖維蛋白的制備 制備蕓豆淀粉樣纖維蛋白，將蕓豆蛋白加入到經Millipore過濾膜處理的溶液中，配制濃度2%的蛋白質溶液，攪拌約1h，將離心機離心后的蛋白質上清液加入到小玻璃試管中，在80℃分別水浴加熱10h和24h。

1.2.3 剛果紅的吸收測定 配制新鮮的剛果紅儲液（pH7.0）。測量前，將剛果紅儲液稀釋成一定濃度的剛果紅工作液，將樣品溶液加入到4mL的剛果紅工作液中，充分振蕩均勻，靜置，使用分光光度計在400～700nm的波長范圍內掃描，所有的樣品測量都使用1cm的石英比色皿，每個樣品重復測量三次。

1.2.4 蛋白溶液流粘度的測定 將未加熱的6%的蛋白液、加熱攪拌的蛋白液和經過加熱處理的2%的蛋白質溶液按照不同的比例混合，在流變儀上操作，測量混合液體的粘度。轉盤直徑 27.83cm，間距1mm。剪切速率0.01～100s-1，每個樣品剪切程序設置為120s，每4s記錄一個數據點，每個樣品粘度重復測量三次。

1.2.5 凝膠性質的測定 將上述未加熱的蛋白液和經過加熱處理的蛋白質溶液按照不同的比例混合，在流變儀上操作測量混合液體加熱后形成凝膠的模量的變化。樣品溶液經過加熱處理后，在常溫的條件下對形成的蛋白質凝膠進行控應變掃描。

1.2.6 掃描電鏡 使用掃描電鏡在常溫下觀察蛋白質凝膠的微結構。根據Muller等人［6］的方法制備樣品，稍有改變。按照不同比例添加淀粉樣纖維蛋白，配制總濃度為6%的蛋白溶液，80℃水浴加熱1h，形成蛋白質凝膠。將形成蛋白質凝膠的樣品切成小立方塊。在戊二醛中浸泡做前固定，再用四氧化鋨做后固定，洗脫干凈后，用不同梯度的乙醇脫水，樣品在二氧化碳臨界點干燥處理，最后將樣品噴金，保持樣品干燥待觀察。操作電壓20kV，電流8mA。

2 結果與討論

2.1 蕓豆分離蛋白

蕓豆分離蛋白（KPI）和淀粉樣纖維蛋白（fibrils）的比例，F0（1/0）、F1（0.75/0.25）、F2（0.5/0.5）、F3（0.25/0.75）和F4（0.5/0.5），其中F1、F2和F3溶液中的淀粉樣纖維使用的是加熱10h的2%的蛋白質溶液，F4使用的是加熱24h的1%的蛋白質溶液。配制不同濃度的分離蛋白使得樣品的最終的蛋白質總濃度為6%。

表1顯示了蕓豆分離蛋白和淀粉樣纖維蛋白不同比例混合以后，形成的溶液和再次加熱形成凝膠的屬性參數變化。可以看出，在蛋白質濃度相同的情況下，蛋白質的淀粉樣纖維所占的比例越高，所形成凝膠的透明度越渾濁。蛋白質溶液的粘度和凝膠的彈性模量也是隨著淀粉樣纖維比例的增大而增高。

在6%的蛋白溶液中，當沒有淀粉樣纖維蛋白存在時，溶液是透明的，當存在淀粉樣纖維蛋白時，溶液變得渾濁，并且隨著淀粉樣纖維蛋白的濃度增加，溶液的渾濁程度也在加大，由澄清透明的顏色變成了橙黃色。在加熱形成蛋白質凝膠后，隨著淀粉樣纖維濃度的加大，凝膠的外觀顏色進一步變渾濁，渾濁度逐漸增加。不同淀粉樣纖維蛋白濃度下的溶液表觀，溶液顏色和濁度的變化可能是淀粉樣纖維蛋白的加入增大了蛋白質聚集的粒徑，產生更多的折射，從而在視覺上產生溶液的渾濁程度隨著淀粉樣纖維濃度的增大而增大的現象。

2.2 剛果紅的吸收

圖1中細實線為剛果紅的吸收曲線，虛線為加熱10h蛋白液的吸收曲線，粗實線為樣品經剛果紅染色后的吸收曲線。蛋白質淀粉樣纖維后的一個顯著的特征就是使用剛果紅標定分析［7］，觀察剛果紅的吸收峰是否向紅外方向發生移動。從圖1的波長掃描可以看出，當蛋白質溶液被加熱10h以后，熱聚集的蕓豆蛋白質剛果紅吸收曲線發生了明顯的移動。這是典型的淀粉樣纖維蛋白存在的特征，說明了蕓豆蛋白在熱處理后發生了淀粉樣纖維的聚集。溶液中的淀粉樣纖維蛋白質與剛果紅發生反應，改變了蛋白質的構象，從而使吸收波長發生了變化。

圖1 淀粉樣纖維化的剛果紅吸收峰偏移

2.3 淀粉樣纖維蛋白的凝膠效果

蛋白質形成凝膠硬度的強弱可以通過流變儀測量表示。在蕓豆蛋白質的凝膠中，五個不同比例的淀粉樣纖維形成的蛋白質凝膠。蛋白質的總濃度為6%，在80℃條件下加熱1h后，從圖2中可以看出，加入不同濃度淀粉樣纖維后形成的凝膠強度相差很大（數據如表1所示）。淀粉樣纖維蛋白占總比例75%的F3與沒有淀粉樣纖維蛋白的F0在總蛋白濃度相同的情況下比較，形成凝膠的彈性模量F3是F0的兩倍多。

圖2（a）的結果說明了在加入淀粉樣纖維的蛋白質溶液加熱形成凝膠后，蛋白質膠體內部交聯的網絡結構發生了變化，加入的淀粉樣纖維增大了凝膠網絡之間的連接。淀粉樣纖維改變了蛋白質內部的構象，形成凝膠后可能在膠體網絡之間形成了新的化學鍵，使之形成更加穩定的結構。圖2（b）的結果說明了蛋白質凝膠在較高的剪切應變作用下，超過了凝膠結構的承受，凝膠開始破裂，這一現象導致tan（δ）的數值隨著剪切應變的加大而增高。

圖2 不同比例的淀粉樣纖維的彈性模量和tan（δ）的示意圖

2.4 淀粉樣纖維的粘度測量

粘度是反映流體性質的一個重要參數。蛋白質溶液的粘度反映了蛋白質加入到溶劑后的溶液的物理性質，粘度大的說明溶液的流體阻力大。將不同淀粉樣纖維蛋白比例的溶液配制好，進行粘度測量。如圖3所示，蛋白質溶液的粘度隨著剪切速率的增大而減小，在相同的剪切速率下，溶液的粘度隨著蛋白質淀粉樣纖維的濃度增大而增大。蛋白質溶液的粘度隨著淀粉樣纖維蛋白的比例增大而增加，而相同比例濃度的蛋白質淀粉樣纖維溶液，加熱10h的蛋白質溶液的粘度要低于加熱24h的溶液粘度。淀粉樣纖維蛋白加入到蛋白溶液后將使整個溶液體系變復雜，而粘度的增大可能是因為蛋白質溶液中加入了淀粉樣纖維蛋白后增大了分子之間彼此的相互作用，從而改變了溶液的粘度。

圖3 不同比例淀粉樣纖維蛋白溶液的粘度

2.5 掃描電鏡

將F0和F2條件下形成的蛋白質凝膠制備成可用于掃描電鏡觀察的樣品。圖4顯示F0和F2為兩種不同結構類型的凝膠。在（a）圖中，F0溶液中僅有蕓豆分離蛋白而沒有添加淀粉樣纖維蛋白凝膠，其結構單一，彼此之間的相互交聯相對不強。圖（b）顯示了存在淀粉樣纖維蛋白的凝膠，并存的多種結構形成的膠體具備較強的凝膠強度。

圖4 掃描電鏡下F0和F2形成的蛋白質凝膠微觀形態（10000×）

表1中的結果顯示，流變儀測定F0形成的凝膠強度要弱于F2形成的凝膠強度。說明淀粉樣纖維蛋白可能形成連續的網絡結構，大量的不同結構增強了膠體的強度，增加了彼此之間的相互作用，形成更加穩定的蛋白質構造。在添加了淀粉樣纖維蛋白后，意味著膠體包含大量的不同結構要多于不加淀粉樣纖維蛋白的膠體，更容易形成蛋白質凝膠，而不加淀粉樣纖維蛋白要形成相同強度的膠體意味著需要更高的蛋白質濃度。

3 結論

在較低的離子強度和pH條件下，溶液中的蕓豆蛋白質聚集后形成線性纖維狀。通過將不同比例的淀粉樣纖維蛋白添加到蕓豆分離蛋白溶液中，可以明顯提高溶液的粘度和所形成凝膠的強度。

實驗結果顯示了蛋白質淀粉樣纖維可以改變蛋白質溶液和由此形成凝膠的新的屬性，這些屬性的改變可以使蛋白質原料應用更廣，開發出一些新的應用領域。蛋白質淀粉樣纖維的程度依賴于加熱時間，較長時間的加熱會提高蛋白質淀粉樣纖維的程度和形成纖維的長度。但是影響蛋白質的淀粉樣纖維程度的還有很多的因素，將使蛋白質溶液系統變得更加復雜，至于各個因素的協調作用效果，有待進一步研究。

［1］Yin S W，Tang C H，Wen Q B，et al.Functional properties and in vitro trypsin digestibility of red kidney bean（Phaseolus vulgaris L）protein isolate：effect of high-pressure treatment［J］. Food Chemistry，2008，110（4）：938-945.

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［3］Carlsson Kanyama A.Climate change and dietary choiceshow can emissions of greenhouse gases from food consumption be reduced［J］.Food Policy，1998，23（3-4）：277-293.

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［6］Muller W H，et al.Field-emission scanning electron microscopy of the internal cellular organization of fungi［J］. Scanning，2000，22（5）：295-303.

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Study on the properties of amyloid fibrils in kidney bean protein solution and gelation

ZHANG Ye-hui1，HUANG Li-hua2，WEN Qi-biao1，TANG Chuan-he1，*
（1.College of Light Industry and Food Sciences，South China University of Technology，Guangzhou 510640，China；2.School of Architecture，Environment and Food Engineering，Guangzhou City Polytechnic，Guangzhou 510405，China）

How protein fibrils could be used to modify the structural properties of concentrated kidney bean protein solutions and gelations were studied.Fibrils could be prepared by being heated at low pH and ionic strength.Fibrils could lead properties to take place big changes of solutions and gelations.The properties of fibrils were tested using congo red.Solutions viscosity and gelations strength were tested by rheometer.Amyloid fibrils microstructure could be observed by scanning electron microscopy.

kidney bean protein；heating assemble；amyloid fibrils；changes of properties

TS231

A

1002-0306（2010）11-0072-04

2009-07-31 *通訊聯系人

張業輝（1979-），男，在讀博士研究生，研究方向：植物蛋白改性研究。

國家自然科學基金（20876057）。