自然發酵風干腸中乳酸菌的分離與鑒定

趙俊仁，孔保華

（1.黃岡師范學院生命科學與工程學院，湖北黃岡438000；2.東北農業大學食品學院，黑龍江哈爾濱150030）

自然發酵風干腸中乳酸菌的分離與鑒定

趙俊仁1，2，孔保華2，*

（1.黃岡師范學院生命科學與工程學院，湖北黃岡438000；2.東北農業大學食品學院，黑龍江哈爾濱150030）

以自然發酵風干腸為研究對象，分析了細菌總數和乳酸菌菌數的變化情況，結果表明，乳酸菌為風干腸發酵過程中的優勢菌群。通過對風干腸中乳酸菌的分離鑒定，共分離出戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）、乳酸乳球菌乳酸亞種（Lactococcus lactis subsp lactis）、短乳桿菌（Lactobacillus brevis）、彎曲乳桿菌（Lactobacillus curvatus）和發酵乳桿菌（Lactobacillus fermentum）5株乳酸菌。24h產酸速率測定結果表明，彎曲乳桿菌＞短乳桿菌＞乳酸乳球菌乳酸亞種＞戊糖片球菌＞發酵乳桿菌。

發酵風干腸，乳酸菌，分離，鑒定

風干腸是我國北方地區具有傳統特色的發酵肉制品，其特點是水分含量低、貯存期長、賦有特殊質地和風味，深受廣大群眾的喜愛。自然發酵風干腸內部的微生物包括原料中固有的和環境中后污染的菌群，乳酸菌是發酵肉制品在自然發酵過程中最易生長的微生物區系。有研究表明乳酸菌能促使亞硝酸鹽分解，減少產品中殘留的亞硝胺［1-2］；同時抑制大腸桿菌、沙門氏菌等致病菌的生長［3-4］。乳酸菌對人體的主要作用是調整腸道環境，即乳酸菌將乳糖分解為乳酸，使腸道形成酸性環境；同時具有賦予產品優良感官性，豐富的營養性和提供安全性的優點。國外早在上世紀20年代就使用乳酸菌進行發酵肉制品的生產。Rantsiou等人從三種歐式發酵香腸中分離出彎曲乳桿菌、植物乳桿菌和清酒乳桿菌［5］。有研究者從意大利發酵香腸中分離出465株乳酸菌［6］。Greco等人從傳統歐式干發酵香腸中分離出112株乳酸菌［7］。本研究旨在通過對自然發酵風干腸內部乳酸菌的分離鑒定，獲得快速產酸的菌株，為肉用復合發酵劑的制備提供優良的微生物菌株，以達到提高生產速率、穩定生產的目的。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

原料肉 宰后6h的新鮮豬臀肉、里脊肉及背脂（4℃保存），購于北大荒肉業；腸衣 豬小腸衣；白砂糖、食鹽、姜、淀粉、調味料等 均由市場購得；微生物生化鑒定管 杭州天和試劑公司；亞硝酸鈉，NaCl，乙酸鈉，吐溫-80，CaCO3，乙醇，甲基紅，二甲基氨基苯甲醛，KOH，對氨基苯磺酸等，MRS（Man-Rogosa-Sharpe）培養基，營養瓊脂培養基，肉腸模擬培養基，產H2S培養基，產H2O2檢測用培養基，硝酸鹽還原培養基、產氨培養基、糖發酵培養基、明膠液化培養基、精氨酸水解培養基、胰蛋白胨水培養基等。

XSZ-G型顯微鏡 OLYMPUS公司；DH5000A電熱恒溫培養箱 連云港醫療器械設備廠；pHS-25型pH計 上海精科雷磁儀器廠；SW-CJ-1FD超凈工作臺 蘇州安泰空氣技術有限公司；TU-1800紫外可見分光光度計 北京普析通用儀器有限公司。

表2 分離乳酸菌的菌體形態特征

1.2 實驗方法

1.2.1 風干腸制作 將原料肉（瘦肉與肥肉比例為9∶1）加入食鹽和亞硝酸鹽后腌制24h，絞碎，肥肉切丁；加入調味料拌餡，灌腸，風干7～10d。

1.2.2 菌數測定 按發酵時間0～10d，每天取樣，每份樣品5.0g，樣品無菌剝去腸衣后剪碎研磨，加入45mL生理鹽水中，4℃下平衡20min。采用營養瓊脂培養基和MRS固體培養基進行平板涂布，將平衡好的樣品梯度稀釋，按發酵天數，適當選取2～3個稀釋度進行涂布，在35℃下培養48h分別測定總菌數與乳酸菌菌數。

1.2.3 乳酸菌的分離 在MRS固體培養基中，選取溶CaCO3圈較大的幾株優勢菌株劃線分離，直到得到純菌株。純化后的菌株分別接種到MRS斜面培養基，置于4℃冰箱中保存備用。

1.2.4 乳酸菌的鑒定

1.2.4.1 形態學鑒定 將分離純化后的菌株涂布到MRS固體培養基上，35℃下培養24h，觀察菌落特征，取典型菌落進行革蘭氏染色，并在油鏡下觀察菌體形態。

1.2.4.2 生理生化實驗 對分離后的菌株進行過氧化氫酶實驗、產硫化氫實驗、葡萄糖產氣實驗、產粘性實驗、硝酸鹽還原實驗、產吲哚實驗、產氨實驗、明膠液化實驗和精氨酸水解實驗；用半固體培養基測定菌株的運動性。

1.2.4.3 耐鹽實驗與耐亞硝酸鹽實驗 將分離菌株分別接種到含有 4%和 6%NaCl以及 150mg/kg NaNO2的MRS液體培養基中，于35℃下培養24h，以不接菌的MRS培養基作空白對照，用紫外分光光度計于600nm下，測定OD值，比較生長情況。

1.2.4.4 糖醇發酵實驗 通過菌株的糖醇發酵實驗，檢驗分離菌株對各種糖醇類碳源的利用情況。

1.2.5 蛋白酶和脂肪酶活性實驗 采用添加15%脫脂乳的MRS固體培養基，分別滴入0.1mL的菌液涂布均勻，35℃培養24h。當牛乳中的酪蛋白被分解后，菌落周圍會出現透明環，以此判定菌種有無分解蛋白質的性質。采用添加15%豬油和中性紅指示劑的MRS固體培養基，分別滴入0.1mL的菌液涂布均勻，35℃培養24h。當菌種分解脂肪產生脂肪酸時，培養基上會出現紅色斑點。

1.2.6 乳酸菌產酸速率的測定 在模擬肉腸培養基中，分別接入分離菌株，在35℃下培養，并測定24h內的pH變化情況。

1.3 統計分析

所得數據為三次測定值的平均值。使用Sigmaplot 9.0（畫圖軟件）作圖，使用Statistix8.1（分析軟件，St Paul，MN）進行統計分析，并進行多重比較（P＜0.05）。

2 結果與討論

2.1 自然發酵風干腸中總菌數與乳酸菌菌數的變化情況

自然發酵風干腸內部微生物變化極其復雜，多數研究表明乳酸菌為發酵肉制品中的優勢菌群，并在發酵過程中起到降低 pH的作用［8］。圖1表明，1～2d內總菌數與乳酸菌菌數顯著上升（P＜0.05），由此推斷總菌數的升高主要由乳酸菌的大量繁殖所導致。整個發酵過程中乳酸菌始終為風干腸內的優勢菌群，控制發酵過程。

圖1 自然發酵風干腸中總菌數及乳酸菌菌數的變化情況

2.2 乳酸菌的鑒定結果

通過各鑒定實驗，從自然發酵風干腸中共分離篩選得到5株乳酸菌，分別編號為L1、L2、L4、L5和L6，基本情況及發酵特性如下。

2.2.1 乳酸菌的形態學鑒定結果 對分離菌株的菌落的大小、顏色、透明度、致密度、邊緣整齊度以及表面光滑程度等指標進行分析。由表1可以看出，自然發酵風干腸中的乳酸菌多數為（灰）白色，菌落表面光滑，邊緣整齊，菌落多數不透明。乳酸菌菌體形態見表2與圖2，均為革蘭氏陽性菌G+；排列方式各不相同，成對、四聯、短鏈或并排鏈狀排列。

表1 分離乳酸菌的菌落形態特征

2.2.2 乳酸菌的生理生化鑒定結果 乳酸菌的生理生化反應與糖發酵實驗結果分別見表3和表4。各分離乳酸菌均不具有運動性、不產粘液、不產硫化

圖2 分離乳酸菌菌體形態圖

表3 乳酸菌的生理生化鑒定結果

表4 乳酸菌糖發酵實驗結果

根據菌體和菌落形態、生理生化實驗及糖發酵實驗結果，對照《伯杰氏細菌鑒定學手冊》［9］和《乳酸細菌分類鑒定及實驗方法》［10］對菌株進行鑒定分析。鑒定結果為：L1為戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）；L2為乳酸乳球菌乳酸亞種（Lactococcus lactis subsp lactis）；L4為短乳桿菌（Lactobacillus brevis）；L5為彎曲乳桿菌（Lactobacillus curvatus）；L6為發酵乳桿菌（Lactobacillus fermentum）。

2.3 乳酸菌對蛋白質和脂肪降解能力的測定

分離5株乳酸菌對蛋白質和脂肪的降解實驗結果見表5。發酵肉制品中的乳酸菌如果具有蛋白質降解活性，則可能降低產品的貨架期，引起腐敗現象；同樣，具有脂肪降解活性的乳酸菌會使產品在儲存銷售過程中出現酸敗味，影響產品質量［11］。由表5可知，各株分離乳酸菌對蛋白質和脂肪均無降解作用，可作為肉用發酵劑使用。

2.4 乳酸菌菌株24h內產酸能力測定

產酸速率是衡量乳酸菌發酵劑品質的重要指標之一。快速產酸可縮短生產周期，并使乳酸菌迅速成為優勢菌群，抑制其它有害菌及致病菌的生長，提高產品的生物安全性。由圖3可見，5株乳酸菌在前3h的pH均呈快速下降趨勢，無顯著差異；6h后，各菌株的pH下降表現出差異性（P＜0.05）。其中，L6下降最緩慢，L5和L1下降最快速。前9h為乳酸菌生長的對數生長期，在此期間乳酸菌大量繁殖，導致pH的迅速下降，基本達到5.0以下。9h后，pH呈小幅度下降，乳酸菌生長進入衰退期。可見，24h內，L6的產酸能力最弱，其他四株乳酸菌相對較強。

圖3 乳酸菌菌株24h內pH的變化情況

3 結論

自然風干腸發酵過程中乳酸菌為優勢菌群，控制發酵過程，對自然發酵風干腸中的乳酸菌進行分離鑒定，得到5株乳酸菌，分別為戊糖片球菌、乳酸乳球菌乳酸亞種、短乳桿菌、彎曲乳桿菌和發酵乳桿菌，其中彎曲乳桿菌產酸最快速。該結果豐富了我國發酵肉制品中優勢乳酸菌的種類，為發酵肉制品的工業化生產提供了更多的菌種選擇。

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Isolation and identification of lactic acid bacteria from the Chinese-style naturally dry fermented sausages

ZHAO Jun-ren1，2，KONG Bao-hua2，*
（1.College of Life Science and Engineering，Huanggang Normal University，Huanggang 438000，China；2.College of Food Science，Northeast Agricultural University，Harbin 150030，China）

The Chinese-style naturally dry fermented sausages were used for this study.The changes of the number of total bacteria and lactic acid bacteria during the process were analyzed.The lactic acid bacteria were predominant microorganism.Lactic acid bacteria included 5 species，there were Pediococcus pentosaceus，Lactococcus lactis subsp lactis，Lactobacillus fermentum，Lactobacillus curvatus and Lactobacillus brevis.The acidifying rate were studied，the results showed that Lactobacillus curvatus＞Lactobacillu brevis＞Lactococcus lactis sub lactis＞Pediococcus pentosaceus＞Lactobacillus fermentum.

naturally dry fermented sausages；lactic acid bacteria；isolation；identification

TS201.3

A

1002-0306（2010）11-0158-04

2010-04-19 *通訊聯系人

趙俊仁（1980-），女，講師，博士，研究方向：畜產品加工。

國家公益性行業（農業）科研專項經費項目（200903012-02）；湖北省教育廳科學技術研究計劃優秀中青年人才項目（08BQ099）；東北農業大學創新團隊發展計劃資助（CXZ011-01）。