鹽干帶魚中乳酸菌的分離鑒定及其生物學(xué)特性研究

陳學(xué)云，侯魯娜，丁玉庭，聶小華

（浙江工業(yè)大學(xué)生物與環(huán)境工程學(xué)院，浙江杭州310014）

鹽干帶魚中乳酸菌的分離鑒定及其生物學(xué)特性研究

陳學(xué)云，侯魯娜，丁玉庭，聶小華*

（浙江工業(yè)大學(xué)生物與環(huán)境工程學(xué)院，浙江杭州310014）

研究了鹽干帶魚加工過程中微生物的消長(zhǎng)規(guī)律，并對(duì)產(chǎn)品中乳酸菌進(jìn)行了分離鑒定和生物學(xué)特性研究。研究結(jié)果表明，鹽干帶魚加工過程中細(xì)菌總數(shù)、酵母、乳酸菌、葡萄球菌和微球菌均呈現(xiàn)逐步增加趨勢(shì)，其中乳酸菌為優(yōu)勢(shì)菌群。從產(chǎn)品中分離得到G+、H2O-2乳酸菌疑似菌株19株，經(jīng)生理生化鑒定初步確定為食品乳酸菌（6株）、短乳桿菌（5株）和戊糖乳桿菌（2株），其它未能鑒定種屬。食品乳桿菌、戊糖乳桿菌和短乳桿菌均表現(xiàn)出良好的生長(zhǎng)性能和耐鹽性，未檢測(cè)到其脂肪酶活性，且僅戊糖乳桿菌表現(xiàn)出弱蛋白酶活性。

鹽干帶魚，乳酸菌，分離鑒定，生物學(xué)特性

鹽干魚是我國(guó)傳統(tǒng)水產(chǎn)品之一，一直以來以其易加工、耐貯藏、口味獨(dú)特而廣受青睞。目前鹽干魚的相關(guān)研究多集中于工藝改進(jìn)［1］，其加工理論尚未開展研究。鹽干加工包括了腌制和干燥工序，加工過程中存在著不同的微生物區(qū)系，其中部分微生物可促進(jìn)產(chǎn)品質(zhì)量的形成，如乳酸菌、葡萄球菌、微球菌、酵母等［2-3］。乳酸菌作為傳統(tǒng)制品中重要微生物之一，是傳統(tǒng)發(fā)酵香腸、干腌牛肉和金華火腿產(chǎn)品中的優(yōu)勢(shì)菌群［4］。研究發(fā)現(xiàn)，乳酸菌可發(fā)酵利用原料中的碳水化合物產(chǎn)生有機(jī)酸，降低pH，抑制一些腐敗菌和致病菌的生長(zhǎng)［5-7］，以及加速產(chǎn)品顏色和質(zhì)構(gòu)的形成。基于此，本論文采用傳統(tǒng)加工方式制備鹽干帶魚，對(duì)產(chǎn)品中乳酸菌進(jìn)行分離鑒定，并研究其生長(zhǎng)特性、蛋白酶活性和脂肪酶活性，以期探討乳酸菌在傳統(tǒng)水產(chǎn)品加工中的應(yīng)用前景。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

帶魚 購于浙江杭州德勝農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)，每尾重400～600g；食鹽 購于浙江杭州樂購超市。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 鹽干帶魚的制備 帶魚去頭去尾去內(nèi)臟，切成魚塊（4cm×4cm），清洗瀝干表面水分。于4℃、12%鹽水中腌制2d后，帶魚魚塊置于25℃下風(fēng)干6d，此時(shí)水分含量為35%～40%。

1.2.2 微生物分析 帶魚魚塊去骨，稱取10.0g樣品，加入90mL無菌蛋白胨溶液（0.1%）的三角瓶中，于無菌條件下勻漿后，進(jìn)行梯度稀釋后，然后選擇2～3個(gè)適宜的稀釋液，采用傾注平板計(jì)數(shù)法。細(xì)菌總數(shù)用PCA培養(yǎng)基，乳酸菌用MRS培養(yǎng)基，葡萄球菌和微球菌用MSA培養(yǎng)基，酵母菌用PDA培養(yǎng)基［8］。

1.2.3 乳酸菌的分離純化 采用平板劃線法。從MRS培養(yǎng)基挑取單個(gè)可疑菌落，在MRS平板上反復(fù)多次劃線培養(yǎng)，獲得純菌株。

1.2.4 乳酸菌的鑒定 對(duì)分離純化得到的疑似菌株進(jìn)行形態(tài)特征鑒別、革蘭氏染色、過氧化氫酶實(shí)驗(yàn)，然后進(jìn)一步進(jìn)行生理生化鑒定。

1.2.5 生長(zhǎng)曲線實(shí)驗(yàn) 待測(cè)菌株接種于MRS液體培養(yǎng)基中，30℃、200r/min下培養(yǎng)18h。吸取一定量菌株培養(yǎng)液接種到MRS液體培養(yǎng)基中，30℃下培養(yǎng)，每隔一定時(shí)間取樣，于680nm下測(cè)定OD值。

1.2.6 耐鹽性實(shí)驗(yàn) 待測(cè)菌株接種于MRS液體培養(yǎng)基中，30℃、200r/min下培養(yǎng)18h。吸取一定量菌株培養(yǎng)液接種到NaCl含量（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）為0、3%、6%、9%、12%、15%的MRS液體培養(yǎng)基中，30℃下培養(yǎng)48h，于680nm下測(cè)定OD值。

1.2.7 蛋白酶活的測(cè)定 采用分別添加15%脫脂牛乳的MRS和營(yíng)養(yǎng)瓊脂固體培養(yǎng)基作為測(cè)定蛋白酶活力的專用培養(yǎng)基。將待測(cè)菌接種于MRS液體培養(yǎng)基中，于30℃，200r/min下培養(yǎng)18h后，無菌吸取0.1mL培養(yǎng)液，接種于蛋白酶檢測(cè)專用培養(yǎng)基中，涂布均勻，30℃下培養(yǎng)48h，若菌落周圍有透明環(huán)，則為有陽性。

1.2.8 脂肪酶活的測(cè)定 采用分別添加15%牛油、中性紅指示劑的MRS和營(yíng)養(yǎng)瓊脂固體培養(yǎng)基作為測(cè)定脂肪酶活力的專用培養(yǎng)基。將待測(cè)菌株接種于MRS液體培養(yǎng)基中，于30℃、200r/min下培養(yǎng)18h后，無菌吸取0.1mL培養(yǎng)液，接種于脂肪酶檢測(cè)專用培養(yǎng)基中，涂布均勻，30℃下培養(yǎng)48h，若培養(yǎng)基上出現(xiàn)紅色斑點(diǎn)，則為陽性。

2 結(jié)果與討論

2.1 鹽干帶魚加工過程中微生物的消長(zhǎng)規(guī)律

實(shí)驗(yàn)中研究了鹽干帶魚加工過程中微生物的消長(zhǎng)規(guī)律，結(jié)果如圖1所示。其中帶魚的起始細(xì)菌總數(shù)為4.39log cfu/g，符合國(guó)家食品一級(jí)品標(biāo)準(zhǔn)。由圖可知，隨著加工時(shí)間的延長(zhǎng)，帶魚中細(xì)菌總數(shù)、酵母、乳酸菌、葡萄球菌和微球菌均呈現(xiàn)逐步增加趨勢(shì)；其中風(fēng)干階段微生物增長(zhǎng)迅速，這主要是干燥溫度、帶魚中水分含量等條件適合微生物的生長(zhǎng)繁殖。經(jīng)風(fēng)干6d后，帶魚中細(xì)菌總數(shù)增至6.24log cfu/g，乳酸菌和酵母的數(shù)量分別增加到5.28log cfu/g和4.38log cfu/g，葡萄球菌和微球菌的總量上升至4.82log cfu/g，這表明各檢測(cè)的微生物之間不存在數(shù)量上的顯著性差異，其中乳酸菌是鹽干帶魚的主要優(yōu)勢(shì)菌群之一。

圖1 鹽干帶魚加工過程中微生物的變化

2.2 鹽干帶魚中乳酸菌的分離鑒定

2.2.1 鹽干帶魚中乳酸菌的初步鑒定 本實(shí)驗(yàn)采用MRS選擇性培養(yǎng)基，從鹽干帶魚中分離純化得到單一菌株，經(jīng)顯微觀察菌落形態(tài)、革蘭氏染色、過氧化氫酶實(shí)驗(yàn)，得到G+、H2O-2菌株19株，初步鑒定均為乳酸菌，且分別編號(hào)為乳酸菌YG-1～YG-19。

2.2.2 鹽干帶魚中乳酸菌的生理生化鑒定 對(duì)上述19株乳酸菌進(jìn)一步進(jìn)行生理生化鑒定實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如表1。所有乳酸菌菌落為白色或乳白色，產(chǎn)酸，可水解明膠和淀粉；查閱細(xì)菌鑒定手冊(cè)［9］，初步確定乳酸菌主要為食品乳桿菌（6株）、短乳桿菌（5株）和戊糖乳桿菌（2株），尚有6株未能鑒定其種類。其中食品乳桿菌為鹽干帶魚產(chǎn)品中的優(yōu)勢(shì)乳酸菌之一，從菌株數(shù)量來說較多。該結(jié)果與傳統(tǒng)肉制品的微生物區(qū)系研究具有較大的差異，如干腌牛肉Cecina產(chǎn)品中乳酸菌屬細(xì)菌主要是食品乳桿菌、戊糖乳桿菌、植物乳桿菌、發(fā)酵乳桿菌、香腸乳桿菌等，其中植物乳桿菌、發(fā)酵乳桿菌為優(yōu)勢(shì)菌［10］；云南干腌火腿中乳酸菌主要是植物乳桿菌、發(fā)酵乳桿菌、彎曲乳桿菌和干酪乳桿菌［11］，這可能是由于加工原料和工藝的不同所導(dǎo)致的。

表1 乳酸菌的生理生化鑒定

2.3 乳酸菌的生長(zhǎng)曲線

實(shí)驗(yàn)中隨機(jī)從分離得到的食品乳桿菌、短乳酸菌和戊糖乳桿菌中各挑選1株菌株進(jìn)行生長(zhǎng)曲線研究，結(jié)果如圖2所示。由圖可知（OD值均稀釋計(jì)算得到），三類乳酸菌均具有良好的生長(zhǎng)特性，其中食品乳桿菌YG-16和短乳桿菌YG-12表現(xiàn)出相似的生長(zhǎng)特性，4h后進(jìn)入生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期，12h后達(dá)到生長(zhǎng)穩(wěn)定期，而戊糖乳桿菌YG-18在培養(yǎng)4h后進(jìn)入生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期，16h后才趨于生長(zhǎng)平緩。比較OD680nm可知，食品乳桿菌YG-16和戊糖乳桿菌YG-18的生長(zhǎng)速率高于短乳桿菌YG-12。

圖2 乳酸菌的生長(zhǎng)曲線

2.4 乳酸菌的耐鹽性

傳統(tǒng)鹽干加工多為高鹽腌制，魚體內(nèi)食鹽含量較高，而食鹽對(duì)微生物的生長(zhǎng)有著明顯的影響。為此，本實(shí)驗(yàn)考察了食品乳桿菌、短乳桿菌和戊糖乳桿菌的耐鹽性，結(jié)果如圖3（OD值均稀釋計(jì)算得到）。研究發(fā)現(xiàn)，三類乳酸菌均受到NaCl的抑制作用，且呈現(xiàn)劑量負(fù)相關(guān)性；當(dāng)NaCl濃度增至6%時(shí)，食品乳桿菌YG-16、短乳桿菌YG-12和戊糖乳桿菌YG-18的吸光度分別下降了17.2%、26.44%和46.79%；當(dāng)NaCl濃度增至15%時(shí)，食品乳桿菌YG-16、短乳桿菌YG-12和戊糖乳桿菌YG-18的吸光度很低，基本無生長(zhǎng)。以上結(jié)果表明，食品乳桿菌YG-16、短乳桿菌YG-12和戊糖乳桿菌YG-18均表現(xiàn)出較強(qiáng)的耐鹽性，在含有9%～12%NaCl的培養(yǎng)基上仍能生長(zhǎng)，其耐鹽性關(guān)系為：食品乳桿菌＞戊糖乳桿菌＞短乳桿菌。

圖3 乳酸菌的耐鹽性

2.5 乳酸菌的蛋白酶活性與脂肪酶活性

實(shí)驗(yàn)中分析了食品乳桿菌、戊糖乳桿菌和短乳桿菌的酶活性，結(jié)果如表2。從表2可知，戊糖乳桿菌YG-18具有較弱的蛋白酶活性，食品乳桿菌YG-16和短乳桿菌YG-12未表現(xiàn)出蛋白酶活性；此外，三類乳酸菌的脂肪酶活性結(jié)果均呈現(xiàn)陰性，說明其不具有脂肪酶活性。

表2 乳酸菌的蛋白酶活性和脂肪酶活性

3 結(jié)論

3.1 鹽干帶魚加工過程中，細(xì)菌總數(shù)、乳酸菌、酵母、葡萄球菌和微球菌的數(shù)量均呈現(xiàn)逐步增加趨勢(shì)。

3.2 從鹽干帶魚中分離得到19株乳酸菌疑似菌，經(jīng)生理生化鑒定初步確定為食品乳桿菌（6株）、短乳桿菌（5株）、戊糖乳桿菌（2株），其余6株乳酸菌未能鑒定其種類。

3.3 食品乳桿菌、戊糖乳桿菌和短乳桿菌均具有良好的生長(zhǎng)性能和耐鹽性，在含有9%～12%NaCl的培養(yǎng)基上仍能生長(zhǎng)。

3.4 食品乳桿菌、戊糖乳桿菌和短乳桿菌均未表現(xiàn)出脂肪酶活性，且僅有戊糖乳桿菌具有弱蛋白酶活性。

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Identification and biological characteristics of Lactic acid bacteria in cured hairtail（Trichiurus haumela）

CHEN Xue-yun，HOU Lu-na，DING Yu-ting，NIE Xiao-hua*
（College of Biological and Environmental Engineering，Zhejiang University of Technology，Hangzhou 310014，China）

The microbial changes during the process of cured hairtai（lTrichiurus haumela）were investigated，and the identification and biological characteristics of Lactic acid bacteria from cured products were also studied.From the results，the counts of total aerobic bacteria，yeast，Lactic acid bacterial，staphylococci and micrococci have been found to increase gradually throughout process，especially at air-drying stage.Lactic acid bacterial were considered as dominant microbe during the cured process.19 strains of Lactic acid bacterial were isolated from the product and identified as Lactobacillus paralimentarius，Lactobacillus brevis and Lactobacillus Pentosus.All of the identified Lactic acid bacteria exited good growth characteristics and salt endurance.Moreover，they have no lipase and only lactobacillus Pentosus has slight protease activity.

cured hairtail；Lactic acid bacteria；identification；biological characteristics

TS254.1

A

1002-0306（2010）11-0165-03

2009-10-10 *通訊聯(lián)系人

陳學(xué)云（1984-），男，碩士研究生，研究方向：食品生物技術(shù)。

國(guó)家863項(xiàng)目（2007AA09Z442）。