橙色紅曲菌乳清苷-5'-磷酸脫羧酶基因的克隆

王伯華，許 楊，，*，李燕萍

（1.南昌大學食品科學與技術國家重點實驗室，江西南昌330047；2.南昌大學中德聯合研究院，江西南昌330047）

橙色紅曲菌乳清苷-5'-磷酸脫羧酶基因的克隆

王伯華1，許 楊1，2，*，李燕萍2

（1.南昌大學食品科學與技術國家重點實驗室，江西南昌330047；2.南昌大學中德聯合研究院，江西南昌330047）

根據已報道的真菌乳清苷-5′-磷酸脫羧酶（pyrG）氨基酸序列，采用CODEHOP策略設計簡并引物，從橙色紅曲菌（Monascus aurantiacus）的基因組DNA中克隆得到pyrG基因片段。然后運用PCR法篩選橙色紅曲菌Fosmid文庫，獲得了pyrG基因全長（GenBank登錄號：GU723506）。經過blastx比較發現，橙色紅曲菌pyrG基因與Aspergillus flavus NRRL3357的氨基酸序列同源性最高，達到81%。該基因能夠作為篩選標記應用于橙色紅曲菌同源轉化系統。

橙色紅曲菌，簡并引物，pyrG基因，基因克隆

乳清苷-5′-磷酸脫羧酶是尿嘧啶核苷酸合成途徑中的一種關鍵性酶，缺乏該酶的營養缺陷株不能在不含尿嘧啶的培養基上生長。通過基因轉化，向其導入含pyrG基因的質粒，可使其恢復在基礎培養基上生長的能力。如果將要導入的基因連接在該質粒上，pyrG可作為外源基因是否導入的標志［1］。紅曲菌（Monascus）是我國傳統的釀造微生物，能產生多種有益的代謝產物：紅曲色素［2］、Monacolin類化合物［3］、γ-氨基丁酸［4］等。近年來，歐美等國對紅曲菌的研究興趣也在不斷增加［5-6］。本實驗采用CODEHOP（ Consensus - Degenerate Hybrid Oligonucleotide Primer）PCR結合 PCR篩選紅曲菌Fosmid文庫的方法克隆了橙色紅曲菌pyrG基因全長，該基因的獲得為橙色紅曲菌同源轉化系統的建立奠定了基礎，也為紅曲菌及其它真菌的新基因克隆提供了一個有效的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

橙色紅曲菌AS3.4384 購自中國科學院微生物研究所；E.coli DH5α 購自Novagen公司；橙色紅曲菌Fosmid文庫 由本實驗室李燕萍博士構建；Taq酶、T4連接酶、pMD18-T載體、限制性內切酶、質粒提取試劑盒及膠回收試劑盒 均購自TaKaRa公司；引物 Invitrogen公司合成。

1.2 實驗方法

1.2.1 簡并引物的設計 根據在NCBI上已經公布的真菌pyrG基因的氨基酸序列，采用CODEHOP［7］策略設計一對簡并引物：

1.2.2 pyrG基因片段的擴增 采用氯化芐法從橙色紅曲菌菌絲體中提取基因組DNA［8］，并以此為模板，用OMP-F和OMP-R引物進行簡并PCR擴增，PCR產物進行 TA克隆，初步篩選陽性克隆子后送Invitrogen公司測序，得到橙色紅曲菌pyrG基因片段序列。

表1 橙色紅曲菌pyrG基因與其它真菌的同源性比較

1.2.3 PCR法篩選橙色紅曲菌Fosmid文庫 根據測序所得pyrG基因片段序列設計一對特異性引物，用于篩選Fosmid文庫：

橙色紅曲菌Fosmid文庫保存于21塊384微孔板中，將每一塊孔板的384個克隆子混合培養并提取質粒DNA，分別命名為Q1～Q21，作為PCR法篩選文庫的模板DNA。當確定陽性克隆子所在的孔板后，分別提取陽性孔板中的每行（編號為A～P）和每列（編號為1～24）的質粒DNA，用作PCR方法定位單克隆子的模板DNA。進一步用PCR驗證單克隆子后提取其質粒DNA備用。

1.2.4 OMPD基因全長的獲得 用各種限制性內切酶對陽性Fosmid單克隆子質粒進行酶切，將1～5kb的酶切片段分別進行回收、克隆、測序。采用DNASTAR軟件對測序結果進行拼接，獲得pyrG基因全長序列。

2 結果與分析

2.1 pyrG基因片段的克隆與分析

以橙色紅曲菌AS3.4384基因組DNA為模板，OMP-F和OMP-R為簡并引物進行PCR反應，在PCR反應退火溫度選擇上，從47～63℃設置了溫度梯度，PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，在431bp的位置出現目的條帶（圖1）。由圖1可以看出，退火溫度低于60℃時會產生許多非特異性條帶，當退火溫度達到63℃時出現特異性目的條帶。

圖1 不同退火溫度下簡并PCR擴增結果

簡并PCR的特異性產物TA克隆后送公司測序。測序結果應用blastx程序進行比對，比對結果表明，由克隆所得基因片段推測的氨基酸序列具有pyrG基因的典型保守區域，可以基本確認所獲得的DNA片段是橙色紅曲菌pyrG基因的部分序列。

2.2 橙色紅曲菌Fosmid文庫的篩選

以Q1～Q21板池混合質粒作為模板，OMP-S1和OMP-S2為引物進行PCR篩選，能夠擴增pyrG目的條帶的有：Q6、Q12、Q17。然后制備Q12板的行池（A～P）和列池（1～24），以這些小混合池作為模板，采用PCR反應分別擴增pyrG基因片段，F行、9列能夠擴增出目的條帶。根據篩選結果，可初步確定陽性克隆子為Q12F9，提取Q12F9單克隆子質粒作為模板，采用 PCR反應對其進一步驗證，能夠觀察到360bp的目的條帶（圖2）。

圖2 PCR法篩選橙色紅曲菌Fosmid文庫

2.3 pyrG基因全長的克隆與分析

選用幾種常用的限制性內切酶對Q12F9質粒進行酶切，酶切結果如圖3。將1～5kb的酶切片段分別進行回收、克隆，經PCR驗證含有pyrG基因片段的陽性克隆子送公司測序。測序結果拼接后獲得了pyrG基因全長。通過blastx檢測與其它真菌的同源性大小（表 1），發現橙色紅曲菌 pyrG基因與Aspergillus flavus NRRL3357的pyrG氨基酸同源性達到81%，說明克隆所得基因為pyrG基因。

圖3 限制性內切酶酶切Q12F9電泳圖

3 討論

傳統簡并引物設計思路是對與目標基因親緣關系比較近的氨基酸序列進行對比后，根據其保守序列和密碼子的簡并性設計出長度在18～23bp的引物序列。由于傳統引物很少考慮到物種的密碼子偏好性，簡并度較高，同時傳統簡并引物的Tm值一般都比較低，這些因素往往導致PCR結果不理想，特異性不高，假陽性率增加。本研究通過CODEHOP策略來設計簡并引物，引物3′端為核心簡并區，5′端為非簡并性夾板結構，5′端夾板結構是根據不同物種密碼子偏好性設計的特異性序列［9］。它大大減少了引物的簡并度且不影響引物的有效性，與傳統方法設計的簡并引物相比，具有擴增特異性高、PCR反應條件易摸索的優點。

常規篩選基因組文庫的方法是通過菌落雜交或將排列在微孔板中的單克隆復制到尼龍膜上篩選陽性克隆［10-11］，費時費力。Green［12］首先提出了采用PCR方法篩選混合池快速定位陽性克隆子，為篩選單克隆減少了很大的工作量，避免了人力和物力的浪費。

本研究采用CODEHOP PCR結合PCR篩選橙色紅曲菌Fosmid文庫的方法克隆了橙色紅曲菌pyrG基因全長，為紅曲菌及其它真菌新基因的克隆提供了一個有效的途徑。該基因全長的獲得為橙色紅曲菌同源轉化系統的構建奠定了基礎。

［1］Hartingsveldt W，Mrttern I E，Zeijl C M J，et al.Development of a homologous transformation system for Aspergillus niger based on the pyrG gene［J］.Mol Gen Genet，1987，206：71-76.

［2］Johanna F G，Jurgen D，Lothar L.Use of Monascus extracts as an alternative to nitrite in meat products［J］.Fleischwirtsch，1991，71（10）：1184-1186.

［3］Heber D，Yip I，Ashley J M，et al.Cholesterol lowering effects of a proprietary Chinese red-yeast-rice dietary supplement［J］.A M J Chin Nuer，1999，69：231-236.

［4］Kono I，Himeno K.Antimicrobial activity of Monascus pilosus IFO 4520 against contaminant of Koji［J］.Biosci Biotechnol Biochem，1999，63：1494-1496.

［5］Blanc P J，Laussac J P，Bars J L，et al.Characterization of monascidin A from Monascus as citrinin［J］.Int J Food Microbiol，1995，27：201-213.

［6］Campoy S，Pérez F，Martín J F，et al.Stable transformation of the azaphilone pigment-producing Monascus purpureus obtained by protoplast transformation and Agrobacterium-mediated DNA transfer［J］.Curr Genet，2003，43：447-452.

［7］Rose T M，Henikoff J G，Henikoff S.CODEHOP（Consensus-Degenerate Hybrid Oligonucleotide Primer）PCR primer design［J］.Nucleic Acids Research，2003，31：3763-3766.

［8］袁勇芳，許楊，李思光，等.紅曲霉DNA提取及其RAPDPCR反應體系的建立［J］.生物技術，2005，18：9-14.

［9］Rose T M，Schultz E R，Henikoff J G，et al.Consensusdegenerate hybrid oligonucleotide primers for amplification of distantly related sequences［J］.Nucleic Acids Research，1998，26（7）：1628-1635.

［10］Ioannou P A，Amemiya C T，Garnes J，et al.A new bacteriophage P1-derived vector for the propagation of large human DNA fragments［J］.Nature Genet，1994（6）：84-89.

［11］Zhang H B，Choi S，Woo S S，et al.Construction and characterization oftwo rice bacterialartificialchromosome libraries from the parents of a permanent recombinant inbred mapping population［J］.Mol Breed，1996（2）：1-14.

［12］Green E D，Olson M V.Systematic screening of yeast artificial chromosome libraries by use of the polymerase chain reaction［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1990，87：1213-1217.

Cloning of Orotidine-5′-phosphate decarboxylase gene from Monascus aurantiacus

WANG Bo-hua1，XU Yang1，2，*，LI Yan-ping2
（1.State key laboratory of Food Science and Technology，Nanchang University，Nanchang 330047，China；2.Sino-Germany Joint Research Institute，Nanchang University，Nanchang 330047，China）

According to the known Orotidine-5′-phosphate decarboxylase，pyrG gene fragment was cloned from Monascus aurantiacus genomic DNA using degenerate primers designed with CODEHOP strategy.And its complete sequence was obtained by a PCR-based method for screening fosmid library（Accession No.GU723506）. After the blastx comparison，the cloned gene was confirmed that it was Monascus pyrG gene with 81%sequence identity to that of Aspergillus flavus NRRL3357.lt can use as a selective marker for Monascus aurantiacus homologus transformation system.

Monascus aurantiacus；degenerate primer；pyrG gene；gene cloning

Q785

A

1002-0306（2010）11-0172-03

2010-04-20 *通訊聯系人

王伯華（1981-），女，博士研究生，主要從事食品生物技術方向的研究。

國家自然科學基金（30860123）。