磺胺喹惡啉人工抗原合成及鑒定

屈艷南，侯玉澤，鄧瑞廣，張改平，*，劉慶堂，職愛民，劉宣兵，李彬彬，柴書軍

（1.河南科技大學食品與生物工程學院，河南洛陽471003；2.河南省農(nóng)業(yè)科學院動物開放式免疫學重點實驗室，河南鄭州450002）

磺胺喹惡啉人工抗原合成及鑒定

屈艷南1，2，侯玉澤1，鄧瑞廣2，張改平2，*，劉慶堂2，職愛民2，劉宣兵1，2，李彬彬1，2，柴書軍2

（1.河南科技大學食品與生物工程學院，河南洛陽471003；2.河南省農(nóng)業(yè)科學院動物開放式免疫學重點實驗室，河南鄭州450002）

國內(nèi)首次用重氮化法將磺胺喹惡啉（SQ）分別與牛血清白蛋白（BSA）和卵清白蛋白（OVA）偶聯(lián)，制備免疫抗原SQ-BSA和包被抗原SQ-OVA。紫外掃描法與SDS-PAGE凝膠電泳法鑒定表明偶聯(lián)成功，偶聯(lián)比分別為10.1∶1、9.8∶1。將SQ-BSA免疫BALB/C小鼠，獲得了高效價、敏感性好的抗SQ血清，表明ELISA方法鑒定偶聯(lián)成功，為進一步制備抗SQ單抗奠定了基礎。

磺胺喹惡啉，人工抗原，鑒定

磺胺喹惡啉（SQ）又名磺胺喹沙啉，是一種高效抗蟲劑、抗菌藥，口服后吸收迅速，對禽類疾病有很好的療效，應用廣泛，但有一定毒性，且易在動物的可食性組織中殘留［1］。由于SQ的良好藥效，養(yǎng)殖場在飼養(yǎng)動物過程中向飼料或動物飲用水中添加SQ，又未完全遵守國家獸藥典規(guī)定的投藥量、投藥期和休藥期的規(guī)定，導致SQ在動物源食品中大量殘留。人食用這些動物源食品后，可能發(fā)生變態(tài)、過敏等反應，嚴重的還會產(chǎn)生致畸、致癌作用。因此世界各國均制定了相對嚴格的獸藥殘留標準，我國及歐盟、日本、美國等西方發(fā)達國家制定其殘留標準為100ng/g［2］。SQ結(jié)構如圖1所示。關于SQ的殘留分析，國內(nèi)外報道較多，主要是高效液相色譜法（HPLC）［3，6］、微生物學方法（SST）［4］，液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析法（LC-MS）［5］。HPLC與LC-MS方法通常需要多個液—液分配（LLE）和濃縮步驟，操作復雜，儀器設備要求高，不便于養(yǎng)殖場用于大規(guī)模篩查自檢，且直接針對SQ的分析較少［7］；SST又難以實現(xiàn)超微水平檢測。試紙條檢測是一種具有特異、敏感、快速、簡便，直觀等優(yōu)點的新型檢測手段。本研究旨在合成SQ人工抗原，為制備SQ單抗及開發(fā)SQ殘留檢測試紙條奠定基礎。

圖1 SQ結(jié)構式

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

磺胺喹惡啉（SQ）、牛血清白蛋白（BSA）、雞卵清蛋白（OVA） 美國Sigma公司；實驗用水為重蒸去離子水（DDW） 實驗室自制；氫氧化鈉等其它試劑

國內(nèi)市售分析純級；實驗動物 SPF級6周齡雌性Balb/C小鼠，購自鄭州大學醫(yī)學院實驗動物中心，由河南省動物免疫學開放式重點實驗室飼養(yǎng)。

U-3000紫外掃描儀（UV） 日本島津；DU-600蛋白核酸分析儀 Beckman公司；3K-18高速冷凍離心機 德國 SIGMA公司；550型酶標儀 美國Bio-Rad公司；凝膠成像系統(tǒng)、HI9321酸度計 美國HANNA公司；超凈工作臺 美國Forma Scientific公司；AE260電子天平 德國METTLER公司；DK-8D電熱恒溫水槽 上海一恒科技有限公司；JM-250電泳儀 大連捷邁科貿(mào)有限公司；2-93自動雙重純水蒸餾器、93-3定時恒溫雙向磁力攪拌器 上海亞榮生化儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 SQ人工抗原的制備 SQ為小分子物質(zhì)（MW =300.4），本身并不具有免疫原性，需要將其偶聯(lián)到大分子載體蛋白上形成人工完全抗原才能免疫動物。根據(jù)SQ的分子結(jié)構與性質(zhì)，采用重氮化反應［8］將它與載體蛋白偶聯(lián)。

免疫抗原（SQ-BSA）制備：稱取 SQ4.0mg，加0.8mL HCl（1mol/L），0～4℃冰浴避光攪拌反應5min，逐滴加入單蒸水溶解的NaOH溶液，KI試紙剛剛變藍時停止加入。攪拌反應5min，加BSA 8mg，調(diào)pH至9，0～4℃冰浴攪拌反應過夜，PBS緩沖液透析7d。偶聯(lián)反應路線見圖2。

圖2 SQ偶聯(lián)反應式

包被抗原（SQ-OVA）的制備：OVA取6.7mg，具體方法及化學物質(zhì)用量同上。

1.2.2 人工抗原的鑒定

1.2.2.1 紫外掃描鑒定及偶聯(lián)比估算 人工抗原的紫外掃描鑒定：將人工抗原用PBS稀釋到適當倍數(shù)后，測定280nm和260nm的OD值，按下式計算蛋白的濃度即抗原的濃度［9］：

蛋白濃度（mg/mL）=1.45OD280-0.74OD260

據(jù)此用PBS緩沖液配制SQ和BSA標準溶液，調(diào)節(jié)SQ與BSA標準溶液濃度與SQ-BSA溶液中蛋白質(zhì)的濃度一致，在波長220～420nm范圍內(nèi)進行紫外掃描，根據(jù)掃描圖譜進行人工抗原鑒定。偶聯(lián)比的估算：將SQ、BSA及SQ-BSA人工抗原配制成一定濃度的溶液，使SQ、BSA溶液濃度與SQ-BSA濃度相同（方法同上），對它們分別進行紫外掃描，得到OD值ASQm、ABSAm（分別為SQ在SQ和BSA最大吸收波長處的OD值）和BSQm、BBSAm（分別為BSA在SQ和BSA最大吸收波長處的OD值）；根據(jù)算式：K=OD值/CL（K為克分子消光系數(shù)；C為各物質(zhì)濃度；L為光徑），分別計算出 KASQm、KABSAm、KBSQm、KBBSAm，分別為 SQ、BSA的兩個摩爾消光系數(shù)。

定點檢測SQ在SQ和BSA的最大吸收波長處的OD值即：ACSQm、ACBSAm。

按下式計算SQ與BSA在SQ-BSA人工抗原中的克分子濃度比，即偶聯(lián)比［9］：

CSQ/CBSA=ACSQm·KBBSAm-ACBSAm·KBSQ/ACBSAm·KASQm-ACSQm·KABSAm

計算SQ與OVA在SQ-OVA中的偶聯(lián)比，方法同上。

1.2.2.2 SDS-PAG凝膠電泳鑒定 配制各種電泳溶液，濃縮膠濃度5%，分離膠濃度10%［10］，濃縮膠電壓120V，分離膠電壓60V，上樣量為20μL，考馬斯亮藍染色3～4h，置脫色液中脫色過夜。

1.2.2.3 動物免疫鑒定 用SQ-BSA疫6周齡雌性BALB/C小鼠5只，免疫劑量50μg/只，0.2mL/只，背部皮下分4～6點注射。首免，用無菌 PBS溶解SQ-BSA，與等量FCA混合，充分乳化；加強免疫，用無菌PBS溶解SQ-BSA，與等量FIA混合，充分乳化，共免4次，每次間隔3周，最后1次免疫后10d斷尾采血分離血清，ELISA方法檢測抗SQ多克隆抗體（pAb）效價及敏感性。

pAb效價測定：采用間接ELISA測定pAb效價。SQ-OVA包被，包被濃度1μg/mL，包被量100μL/孔，37℃溫育2h，PBST洗板4次，每次間隔3min（下同）；用5%豬血清封閉200μL/孔，37℃溫育1h，洗板；加多抗血清（pAb），50μL/孔，用封閉液倍比稀釋，設陰性對照（NC）和空白對照（BC），37℃溫育15min，洗板；加RaMIgG-HRP，1∶1000用封閉液稀釋，50μL/孔，37℃溫育25min，洗板；加酶底物TMB顯色100μL/孔，RT10min；終止反應，100μL/孔2mol/L H2SO4，讀OD450nm值；結(jié)果判斷，以待測孔OD450nm值≥NC OD450nm值的2.1倍（P/N≥2.1），判為陽性［11］。

敏感性鑒定：采用阻斷ELISA鑒定其敏感性。SQ-OVA包被，包被濃度1μg/mL，包被量100μL/孔，37℃溫育2h，PBST洗板4次，每次間隔3min（下同）；5%豬血清封閉，200μL/孔，37℃溫育1h，洗板；加OD450nm為1.0的小鼠血清50μL和不同濃度的SQ標準品作抑制劑，設NC和BC，37℃溫育15min，洗板；加RaMIgG-HRP，1∶1000用封閉液稀釋，每孔50μL，37℃溫育25min，洗板；加酶底物TMB顯色，每孔100μL，室溫反應10min；終止顯色反應，每孔加入終止液2mol/L H2SO4100μL，用酶標儀讀OD450nm值；計算抑制率（B/B0，B0為SQ0濃度的標準品吸光值，B為其他SQ不同濃度的標準品吸光值）［12］。以B/ B0為縱坐標，以SQ濃度的對數(shù)值為橫坐標，在半對數(shù)坐標軸上繪制SQ對SQ pAb的抑制曲線，根據(jù)曲線趨勢推導回歸方程，計算SQ pAb對SQ的50%抑制濃度（50%Inhibitive concentration，IC50），以IC50衡量其敏感度。

2 結(jié)果與分析

2.1 人工抗原的鑒定結(jié)果

2.1.1 UV鑒定結(jié)果 如圖3。由圖可見，SQ-BSA曲線與BSA曲線形狀差異較大，280nm處的BSA特征吸收峰與253nm處SQ特征吸收峰疊加并位移至261nm處，在253nm SQ特征吸收峰處SQ-BSA吸收峰明顯上升，表明人工抗原偶聯(lián)成功［13］。

表1 間接ELISA測小鼠抗SQ血清效價

表2 小鼠抗血清對SQ的抑制效價

圖3 BSA、SQ和SQ-BSA的紫外掃描光譜

因此確定SQ已與兩種載體蛋白都偶聯(lián)成功。根據(jù)公式可以算得 SQ-BSA的偶聯(lián)比為10.1∶1，SQ-OVA偶聯(lián)比為9.8∶1。

2.1.2 SDS-PAGE鑒定結(jié)果 如圖4。由圖可見，BSA的泳動速度大于SQ-BSA，說明SQ-BSA的分子量大于BSA，證明SQ與BSA已成功偶聯(lián)［14-15］。

圖4 SQ-BSA偶聯(lián)物的SDS-PAGE鑒定

2.1.3 pAb鑒定結(jié)果

2.1.3.1 間接ELISA效價測定結(jié)果 結(jié)果見表1。由表可知，免疫的3只小鼠血清抗體效價均達到了10-3，說明獲得了較好的免疫效果，其中2號小鼠效價最高為1∶6.4×103。

2.1.3.2 SQ pAb敏感性鑒定 結(jié)果見表2。SQ在10000～156.25μg/mL范圍內(nèi)，3只小鼠均產(chǎn)生了抑制，其中3號小鼠抑制效果最好，將其OD450nm值轉(zhuǎn)化為B/B0，再對Lg［SQ/100］進行回歸分析，3號小鼠的線性回歸方程為 y=-0.2319x+1.0346，R2為0.9795，IC50為201.9761ng/mL，見圖5。

3 討論

SQ存在活性基團伯氨基，以Landsteiner創(chuàng)立的小分子半抗原與大分子載體交聯(lián)合成完全抗原理論［16］為基礎，對于帶有氨基的半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)一般采用重氮化法和戊二醛（GA）法，本研究對這兩種方法進行了比較，結(jié)果表明重氮化法優(yōu)于GA法，進一步證實了重氮化法適用于芳香胺而GA法適合于脂肪胺的報道［17］。影響人工抗原免疫原性的因素有多種，主要因素包括載體蛋白的性質(zhì)、半抗原的分子空間結(jié)構、間隔臂的長度和分子結(jié)合比。本研究選用理化性質(zhì)穩(wěn)定，不易變性，價廉易得的BSA作載體蛋白，BSA分子內(nèi)含自由氨基多，在較大pH范圍和不同離子強度下均能保持較大的溶解度，更有利于偶聯(lián)反應的進行。間隔臂的介入長度要合適，過短則載體蛋白的空間位阻將影響細胞對半抗原的識別，不產(chǎn)生特異性抗體，本研究以-N=N-作間隔臂，長度適宜，有助于半抗原結(jié)構的暴露，有利于特異性抗體的產(chǎn)生，不會形成新的抗原表位［18］，避免了“橋抗體”的出現(xiàn)，又產(chǎn)生了針對SQ的特異性抗體。

本研究成功合成了SQ人工抗原，免疫BALB/C小鼠制備出高價、特異的pAb，為抗SQ單克隆抗體（mAb）的進一步研制及其免疫學分析方法的建立奠定了基礎。

圖5 SQ pAb對SQ的阻斷ELISA抑制曲線

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Synthesis and identification of sulfaquinoxaline antificial antigen

QU Yan-nan1，2，HOU Yu-ze1，DENG Rui-guang2，ZHANG Gai-ping2，*，LIU Qing-tang2，ZHI Ai-min2，LIU Xuan-bing1，2，LI Bin-bin1，2，CAI Shu-jun2
（1.Henan University of Scienceand Technology，Luoyang 471003，China；2.Henan Key Laboratory for Animal Immunology，Zhengzhou 450002，China）

The diazotization was adopted to link SQ to the carrier proteins BSA and OVA to prepare the immunogen SQ-BSA and test coating antigen SQ-OVA.Also，SQ-BSA and SQ-OVA were confirmed by ultraviolet scanning and SDS-PAGE.The conjugationratio of SQ-BSA and SQ-OVA were 10.1∶1 and 9.8∶1，respectively.The polyclonal antibody with high titre and sensitivity were also gained by immunizing the BALB/C mice with SQ-BSA.These results indicated that the hapten SQ was successfully linked to the carrier proteins，which also lay the foundation for further gain monoclonal anti-SQ.

sulfaquinoxaline；artificial antigen；identification

Q939.91

A

1002-0306（2010）11-0178-04

2009-08-17 *通訊聯(lián)系人

屈艷南（1983-），女，在讀碩士研究生，研究方向：食品藥殘快速檢測。

“十一五”國家科技支撐計劃（2006BAK02A21）。