蛹蟲草深層培養產纖溶酶條件的優化

陳慧鑫，劉曉蘭，李巍巍，時 晰，鄭喜群

（齊齊哈爾大學食品與生物工程學院，黑龍江省農產品加工重點實驗室，黑龍江齊齊哈爾161006）

蛹蟲草深層培養產纖溶酶條件的優化

陳慧鑫，劉曉蘭*，李巍巍，時 晰，鄭喜群

（齊齊哈爾大學食品與生物工程學院，黑龍江省農產品加工重點實驗室，黑龍江齊齊哈爾161006）

蛹蟲草是名貴中藥材之一，本課題組發現其液體發酵物中含有較強的纖溶活性物質，具有開發成溶栓藥物的潛力。以本實驗室已優化的蛹蟲草深層培養產纖溶酶的培養條件為基礎，對蛹蟲草深層培養產纖溶酶的條件進一步優化，并對其深層培養產纖溶酶過程從搖瓶條件到10L發酵罐進行比擬放大。實驗結果表明：蛹蟲草深層培養產纖溶酶的最適培養條件為蔗糖2%、豆餅5%，250mL三角瓶裝液量為50mL，23℃培養5d，培養基初始pH為自然（6.0左右），接菌量為直徑1cm菌片一片（每50mL）或深層培養3～5d的液體菌種0.5%（V/V）；10L發酵罐在攪拌轉速和通風量為100r/min，600L/h的條件下纖溶酶活力達286.21U/mL（尿激酶單位），較搖瓶條件下的酶活力提高了3.2倍，纖溶酶對菌絲生物量的得率較搖瓶條件下提高了5.5倍。

蛹蟲草，深層培養，纖溶酶，發酵罐

蛹蟲草（Cordyceps militaris（L.）Link）又名北冬蟲夏草，隸屬于蟲草屬（Cordyceps），在我國的黑龍江、吉林、遼寧等省份都有野生分布［1-2］，蛹蟲草中含有核苷類、多糖類等多種有效成分［3-5］，具有補虛損、益精氣、保肺、益腎、滋補強壯等功效［6-9］，其藥用價值可與人參和鹿茸相媲美。近年來人們對蛹蟲草的生物學特性、藥理作用等方面進行研究，取得了一些成果［10-12］。本課題組發現蛹蟲草液體發酵物中含有較強的纖溶活性物質，具有開發成溶栓藥物的潛力。血栓性疾病是嚴重危害人類健康的疾病之一，其致殘率和死亡率較高［13］。目前國內外已正式批準臨床使用的溶栓藥物有鏈激酶（SK）、尿激酶（UK）、組織型纖溶酶原激活劑（t-PA）等，這些藥物療效肯定，但還存在許多缺陷，且價格昂貴，因此，研制新型溶栓藥物的需求迫切。微生物種類繁多，生長迅速，是獲得溶栓劑的重要來源。日本學者在納豆中發現了納豆激酶（NK）［14-15］，激發了人們從微生物中尋找新型溶栓劑的熱情，幾種微生物來源的纖溶酶陸續在中國豆豉［16-17］，韓國大豆醬［18］，韓國咸魚［19］，亞洲傳統食品蝦醬［20］，印尼豆豉［21］等發酵食品中被發現。本課題組在蛹蟲草液體發酵物中純化得到了兩種新的纖溶酶（專利“一種真菌纖溶酶及其培制方法（200810137564.4）”和“一種蛹蟲草纖溶酶及其培制方法（200910073373.0）”），并發現它們的性能良好（另文發表）。目前關于大型真菌深層培養生產酶類的研究大多局限于搖瓶條件，生產規模小，難以滿足需求，而利用發酵罐深層培養大型真菌生產酶類產物未見報道。本文對蛹蟲草深層培養產纖溶酶的條件進行優化，并在10L發酵罐中進行比擬放大，為蛹蟲草纖溶酶的工業化生產奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

蛹蟲草（Cordyceps militaris） 由齊齊哈爾大學食品與生物工程學院提供；改良PDA斜面/平板培養基 葡萄糖1%，蛋白胨0.5%，KH2PO40.1%，MgSO40.05%，瓊脂2.5%，20%土豆汁，pH自然；發酵培養基 蔗糖2%，豆餅5%。

1.2 實驗方法

1.2.1 深層培養方法 初始培養條件為蔗糖2%、豆餅5%，250mL三角瓶裝液量為50mL，接種量為直徑1cm菌片1片，23℃、180r/min培養。優化培養條件的過程以初始條件作對照，每一實驗條件做三個平行。

1.2.2 蛹蟲草纖溶酶活力的測定 發酵液在10000r/min、4℃離心10min，取上清液10μL點于血纖維蛋白平板上，37℃保溫6h，測定溶圈直徑，計算面積，纖溶酶活力與溶圈面積呈正相關，由于不同批次市售尿激酶標定活力單位存在差異，致使標準曲線不統一，因此本實驗暫采用10μL發酵液在血纖維蛋白平板上的溶圈面積表示溶栓酶活力。

1.2.3 血纖維蛋白平板制備（配制10個平板） 參照Astrup［22］方法，有所改動，取0.25g瓊脂糖加入50mL生理鹽水中，加熱溶解后置45℃水浴中保溫30min后加入500U/mL的凝血酶500μL，混勻。取2支80mg/支血纖維蛋白原溶于50mL巴比妥鈉緩沖液（pH7.8）中，置45℃水浴中保溫5min。分別取5mL凝血酶溶液與5mL血纖維蛋白原溶液混合均勻后，快速倒入φ9cm平皿中，水平放置30min后置冰箱中備用。

1.2.4 菌絲生物量的測定 發酵液在10000r/min、4℃離心10min，沉淀物上層為菌絲體，下層為豆餅渣，將菌絲體與豆餅渣分離后用蒸餾水洗滌3次，60℃烘干至恒質量，測菌絲體生物量。

1.2.5 KLa的測定 搖瓶條件下及10L發酵罐中的KLa測定采用亞硫酸鈉氧化法［23］。

2 結果與討論

2.1 初始培養條件的確定

酶的生物合成受基因和培養環境的雙重控制，纖溶酶作為一種誘導酶，底物選擇尤為重要。微生物培養過程中，碳源可構成菌體及目標產物的碳骨架、并可為其代謝提供能源；氮元素是細胞內蛋白質、核酸等的重要組成部分。本課題組在前期的實驗中對5種碳源（蔗糖、葡萄糖、淀粉、麥芽糖、土豆汁）和5種氮源（大豆粉、豆餅粉、豆粕粉、豆漿、玉米蛋白粉）進行了篩選，并對碳氮源的適合比例進行了實驗考察。結果表明，以蔗糖2%，豆餅5%為培養基時，纖溶酶產量最高。

本實驗考察了培養溫度（18，21，23，25，27℃）對纖溶酶產量的影響。結果表明，溫度在21～25℃范圍內，菌體產酶活力變化不大，23℃時酶活略高，當溫度低于21℃或高于27℃時，產酶明顯受到抑制，因此在實際生產過程中，只要控溫在21～25℃即可。

搖瓶培養過程中，在搖床轉速一定的情況下，不同的裝液量會對菌體的生長及其代謝產物產生較大的影響。本實驗考察了裝液量（250mL三角瓶中裝液量為30、40、50、60、70mL）對纖溶酶產量的影響，結果表明，在裝液量30～50mL的范圍內，纖溶酶產量變化不大，裝液量超過50mL，纖溶酶產量則呈現下降趨勢，在發酵生產過程中，相同的空間裝液量大，可獲得更多的目標產物，故本實驗選取250mL三角瓶裝液量為50mL。

2.2 培養時間的確定

特定培養條件下的微生物生長曲線對指導發酵生產具有重要意義，可根據需要在不同時期進行收獲。工業生產中一般要獲得目標產物最大產量，還要節省生產成本，因此，確定最適培養時間意義重大。按初始培養條件深層培養蛹蟲草8d，每隔24h取樣，測定發酵液中的纖溶酶產量，實驗結果如圖1所示。

圖1 培養時間對纖溶酶產量的影響

結果表明，發酵至第3d后開始產酶，到第5d時，酶活趨于穩定，之后隨時間延長，酶活沒有明顯增加。雖然第6d酶活略高于第5d，但考慮到實際生產效率問題，將最適培養時間定為5d。

2.3 培養基初始pH的確定

pH對微生物的生命活動有很大影響，其影響微生物原生質膜所帶電荷以及某些營養物質的分解和電離程度，從而影響微生物對養分的吸收以及代謝產物的生成。分別用0.2mol/L及2mol/L鹽酸和氫氧化鈉逐個調節發酵培養基初始pH為3～10，以pH自然（6.0）做對照，培養條件同上。實驗結果如圖2所示。

實驗結果表明，發酵液初始pH在5～8范圍內，菌體產酶活力變化不大。低于5或高于8時，酶活明顯受到抑制，因發酵培養基初始pH為6.0左右，所以無需調整。王永敏［24］等在研究pH對蛹蟲草菌絲體與胞外多糖得率的影響中也發現初始pH在6.5～8范圍內，目標產物的得率無顯著差異。微生物的代謝活動還會改變所處環境的pH，本實驗中發現蛹蟲草菌有調節環境pH能力，無論初始pH如何，培養環境pH都有向中性變化的趨勢，說明蛹蟲草菌發酵過程中可能既能發酵糖產生酸性物質，也有蛋白脫羧產氨作用。在環境pH為堿性時，可能發酵糖產酸作用占主導；在環境pH為酸性時，可能蛋白脫羧產氨作用占主導。

圖2 培養基初始pH對纖溶酶產量及發酵終點pH的影響

2.4 接種量的確定

采用較大的接種量可縮短菌體生長達到高峰的時間，使產物的合成提前，但如接種量過大，可能使菌體生長過快，培養液黏度增加，溶氧不足，影響產物的合成；此外，接菌量過大也會導致前培養成本增加。而接菌量過低，菌體生長緩慢，會嚴重影響生產效率，因此，適宜接菌量的確定至關重要。在基本發酵培養基中，分別接入直徑為1cm的菌苔圓片1～5片，培養條件同上。結果如圖3所示。

圖3 接種量對纖溶酶產量的影響

結果表明，實驗范圍內接菌量對菌體產酶影響不大，從經濟角度考慮，將接菌量定為直徑1cm菌片一片。

2.5 液體菌種接種量和菌齡的確定

工業生產中多將斜面保藏的菌種接入液體培養基中，制成二級液體種子，再利用二級種子作為深層培養的接種物，該法可有效地提高接種量，同時縮短菌種從固體到液體培養的適應時間，縮短菌體生長停滯期，從而縮短生產周期，提高生產效率。基于此，在基本發酵培養基中，分別接入深層培養3d的二級蛹蟲草菌種0.5%，1%，1.5%，2%，2.5%（V/V），培養條件同上。結果如圖4所示。

結果表明，在實驗考察范圍內液體菌種的接種量對纖溶酶產量影響較小，各水平獲得的纖溶酶產量相當。其原因可能為蛹蟲草深層培養的周期較長，初期因接菌量的不同而導致纖溶酶產量的差異隨培養時間的延長而變得不明顯。較小的接菌量節約了前培養成本，即0.5%（V/V）較適合作為液體菌種接菌量。文庭池［25］在蛹蟲草高產蟲草菌素的深層培養工藝研究中發現接種量對蛹蟲草的生物量和蟲草素的產量只有很小的影響，此結論與本實驗的優化結果相同。

圖4 液體接菌量對纖溶酶產量的影響

真菌生長曲線有別于細菌典型生長曲線，可分為生長停滯期、迅速生長期、衰退期三個階段。在生長停滯期，菌體調整酶系以適應新的培養環境；迅速生長期中碳、氮等元素被迅速利用，呼吸強度達到頂峰，一些代謝產物積累；衰退期中有些真菌菌絲體自溶，有毒代謝產物積累。確定合適生長時期的液體菌種對酶生產意義重大。在基本發酵培養基中接入培養1～8d的液體種子（接菌量為0.5%），培養條件同上，結果如圖5所示。

圖5 菌種的菌齡對纖溶酶產量的影響

結果表明，液體菌種菌齡為3～5d時，蛹蟲草深層培養產纖溶酶的量差別不大。菌齡在小于3d時，纖溶酶的產量是逐漸增加的；菌齡大于5d以后，纖溶酶的產量逐漸減少了。原因可能是3～5d的液體菌種正處于迅速生長期，菌體代謝旺盛，生長快速，較適合作為蛹蟲草深層培養產纖溶酶的液體菌種。

2.6 10L發酵罐中試實驗

經過優化，蛹蟲草在搖瓶培養條件下可獲得較高的纖溶酶產量，但搖瓶條件生產纖溶酶，由于其生產規模較小而難以滿足需求，因此必須將搖瓶中優化好的深層培養條件在大型的設備中予以重現，以實現大規模生產。氧是好氧發酵的限制性基質，所以氧的提供往往就成為好氧微生物代謝產物形成的重要影響因素。早在20世紀50年代，就有學者提出以KLa為原則進行發酵工藝放大，并在實踐中取得了較好的結果［26］。本實驗根據KLa相同的原則進行比擬放大，10L發酵罐在攪拌轉速和通風量分別在50r/min，700L/h；100r/min，600L/h；150r/min，500L/h下的KLa與搖瓶條件下的KLa較為接近。根據初步確定的攪拌轉速和通風量進行實罐發酵，10L的發酵罐中裝液量為7L，其他條件同搖瓶培養條件，每隔12h取樣，測定纖溶酶活力，并以搖瓶的實驗結果做對照，結果如圖6所示。

結果表明，在10L發酵罐中，攪拌轉速100r/min，通風量600L/h的深層培養條件下，蛹蟲草纖溶酶的產量明顯高于搖瓶條件下纖溶酶產量，發酵時間為108h時纖溶酶活力達到最高，在血纖維平板上的溶圈面積可達214.28mm2（相當于尿激酶286.21U/mL），比搖瓶條件下纖溶酶溶圈面積154.74mm2（相當于尿激酶89.26U/mL）大38.48%；在攪拌轉速50r/min，通風量700L/h的深層培養條件下，蛹蟲草纖溶酶的產量與搖瓶條件下纖溶酶產量較為接近，但未超過搖瓶條件下的纖溶酶產量；攪拌轉速150r/min，通風量500L/h的深層培養條件下，蛹蟲草纖溶酶的產量明顯低于搖瓶條件下纖溶酶產量。因此，在考察范圍內，攪拌轉速100r/min，通風量600L/h的深層培養條件較適合作為10L發酵罐深層培養蛹蟲草生產纖溶酶的培養操作條件。

表1 纖溶酶產量最大時纖溶酶對菌絲體的得率

圖6 10L發酵罐中不同培養條件對纖溶酶產量的影響

藥用真菌深層培養產生的活性代謝產物含量相對較低，在工業化生產中，如果僅以一種產物為目的，將耗費大量成本，因此應開展多產物聯產發酵研究。蛹蟲草作為高級的滋補品，其菌絲體具有較高的經濟價值，在深層培養蛹蟲草生產纖溶酶的過程中，蛹蟲草的菌絲體作為副產物可被收集加工成為保健品和滋補品，從而實現纖溶酶和蛹蟲草菌絲體的聯產，提高經濟效益，減少資源的浪費。在10L發酵罐實罐發酵的過程中，同時監測菌絲生物量，在保證纖溶酶產量的前提下，盡可能地收集蛹蟲草菌絲，實驗結果如圖7所示。

圖7 10L發酵罐中不同培養條件對蛹蟲草菌絲生物量的影響

結果表明，在考察范圍內，菌絲體隨攪拌轉速的增加呈現遞增趨勢，其可能的原因是隨攪拌轉速的增加，培養基的混合更加均勻，從而提高了蛹蟲草對底物的的利用率，其中在攪拌轉速150r/min，通風量500L/h的深層培養條件下，蛹蟲草菌絲生物量在120h時可達 34.48g/L，比搖瓶條件下的最大值28.81g/L提高了19.68%。本課題組李春麗［27］等在蛹蟲草深層培養產菌絲體及胞外多糖的研究過程中，實現了蛹蟲草菌絲體和胞外多糖的聯產，并利用10L發酵罐進行比擬放大，使菌絲體和胞外多糖的產量也較搖瓶條件下均有較大提高。

10L發酵罐中不同深層培養條件下，纖溶酶產量最大時，纖溶酶對菌絲體的得率如表1所示。

表1的結果表明，在10L發酵罐中，攪拌轉速100r/min，通風量600L/h的培養條件下，纖溶酶的得率相對最高，較搖瓶條件下提高了5.5倍。

3 結論

本論文以蛹蟲草為菌種，對其深層培養產生纖溶酶的部分工藝條件進行了優化，并利用優化的工藝條件在10L發酵罐中進行了中試實驗，取得主要結論如下：蛹蟲草深層培養產纖溶酶的最適培養條件為蔗糖2%、豆餅5%，250mL三角瓶裝液量為50mL，23℃培養5d，發酵液初始pH為自然（6.0左右），接菌量為直徑1cm菌片一片（每50mL）或深層培養3～5d的液體菌種0.5%（V/V）；10L發酵罐在攪拌轉速和通風量為100r/min，600L/h的條件下，纖溶酶的溶圈面積可達 214.28mm2，相當于尿激酶286.21U/mL，較搖瓶條件下的酶活力提高了3.2倍，纖溶酶對菌絲生物量的得率較搖瓶條件下提高了5.5倍。

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Optimization of submerged culture conditions for the production of fibrinolytic enzyme with Cordyceps militaris

CHEN Hui-xin，LIU Xiao-lan*，LI Wei-wei，SHI Xi，ZHENG Xi-qun
（College of Food and Biology Engineering，Qiqihar University，Heilongjiang Key Lab of Agricuhural Product Processing，Qiqihar 161006，China）

Cordyceps militaris is one of the medicinal mushrooms.A kind of enzyme with stronger fibrinolytic activity was found in the fermentation culture fluids of Cordyceps militaris，which had potential for treating thrombus.The fermentation conditions for the fibrinolytic enzyme production with Cordyceps militaris，which based on optimized condition in our laboratory，were further investigated.And the process of the fibrinolytic enzyme production was scaled-up from 250mL flask to 10L fermentor.The results showed that the best conditions for the fibrinolytic enzyme production were 250mL flask containing 50mL medium，which was composed of sucrose2%and bean cake 5%. The fermentation time was 5d under the temperature of 23℃.Keeping the initial pH of culture medium natural condition（about 6.0）was better for the fibrinolytic enzyme production.The better inoculums size was punching out 1cm mycelia cultures into 50mL liquid fluids of 250mL flask.0.5%（v/v）liquid spawn of 3～5d was also better.The fermentation of 10L fermentor under the conditions of agitation rate 100r/min and aeration rate 600L/h got a better result for the fibrinolytic enzyme production.The area of the fibrinolytic enzyme active reached 286.21U/mL（urokinase），which was 3.2 times more than the results of flask.The yield was 5.5 times more than the results of flask.

Cordyceps militaris；submerged culture；fibrinolytic enzyme；fermentor

TS201.2+5

A

1002-0306（2010）11-0216-05

2010-08-23 *通訊聯系人

陳慧鑫（1984-），男，在讀碩士，研究方向：微生物遺傳。

黑龍江省科技計劃項目（GB08B401-04）。