真菌甲殼素脫乙酰酶(CDA)研究進(jìn)展

朱利平，黃惠莉

（華僑大學(xué)化工學(xué)院，福建廈門361021）

真菌甲殼素脫乙酰酶(CDA)研究進(jìn)展

朱利平，黃惠莉*

（華僑大學(xué)化工學(xué)院，福建廈門361021）

甲殼素脫乙酰酶（Chitin deacetylase，CDA）可以脫去甲殼素上N-乙酰-D-葡糖胺的乙酰氨基，使之轉(zhuǎn)化成殼聚糖。殼聚糖是一種具有特殊性質(zhì)的生物多聚物，在食品、醫(yī)藥、化工等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景，它也是很好的食物纖維，對(duì)人體生理活動(dòng)起著多方面的調(diào)節(jié)作用，在食品工業(yè)和醫(yī)藥方面有重要應(yīng)用價(jià)值。本文概述了真菌中CDA的研究進(jìn)展，包括真菌CDA的來源、純化和酶學(xué)性質(zhì)，在生物體內(nèi)的功能、基因、作用方式和結(jié)構(gòu)機(jī)制，并探討了今后研究的方向。

甲殼素脫乙酰酶，甲殼素，殼聚糖

甲殼素是2-乙酰氨基-2-脫氧-β-D-葡萄糖（GlcNAc）通過（1→4）糖苷鍵連接形成的線性同聚物，是自然界中含量最豐富、最易獲得、可再生的聚合物之一，僅次于纖維素。但是甲殼素不溶于水和有機(jī)溶劑，所以其沒有太大的商業(yè)價(jià)值，在工業(yè)上沒有重要的應(yīng)用，而且甲殼素的堆積會(huì)造成蚊蠅滋生、河流污染等環(huán)境問題。但是甲殼素N端脫乙?；蟮难苌铩?dú)ぞ厶蔷哂袕V泛的用途［1-3］，而且隨著社會(huì)的發(fā)展和人們對(duì)健康的認(rèn)識(shí)，對(duì)殼聚糖的品質(zhì)和產(chǎn)量的需求也與日俱增，生產(chǎn)殼聚糖及其寡聚物具有相當(dāng)大的商業(yè)前景。但是目前為止，工業(yè)上生產(chǎn)殼聚糖一般是通過熱化學(xué)方法脫去甲殼素上的乙酰基而實(shí)現(xiàn)的。這個(gè)過程耗能大，需要大量的強(qiáng)堿，排放的廢水對(duì)環(huán)境有很大的危害，并且整個(gè)脫乙酰過程不易控制，多糖在熱堿中易降解，會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)出的殼聚糖分子量和脫乙酰度不均一。相對(duì)于化學(xué)法，利用生物酶法生產(chǎn)殼聚糖已經(jīng)引起了廣泛的關(guān)注，這種方法具有新穎、環(huán)境友好、無降解以及可以形成特定位點(diǎn)脫乙酰的產(chǎn)物等優(yōu)點(diǎn)，其中甲殼素脫乙酰酶起重要作用。甲殼素脫乙酰酶，簡(jiǎn)稱 CDA（EC3.5.1.41），它可以對(duì)甲殼素上的GlcNAc進(jìn)行脫乙酰作用，催化甲殼素轉(zhuǎn)化為殼聚糖（圖1），在CAZY數(shù)據(jù)庫(kù)中，CDA屬于糖脂酶家族4（CE-4s）成員［4］，這種酶是在Mucor rouxii提取物中首次發(fā)現(xiàn)的，隨后在其他真菌［5，6-9］和昆蟲［8］中都有關(guān)于CDA的報(bào)道。本文主要綜述了真菌CDA的酶學(xué)性質(zhì)，在生物體內(nèi)作用、基因水平以及作用方式和結(jié)構(gòu)機(jī)制，并對(duì)CDA的應(yīng)用前景和發(fā)展方向做了簡(jiǎn)單的展望。

圖1 甲殼素脫乙酰酶催化方式［1］

1 真菌CDA純化與酶學(xué)性質(zhì)

不同真菌CDA的分子量為27～150kDa，最適溫度為37～60℃，最適pH為4.5～8.5，具有激活劑和抑制劑不同（表1）。

大多數(shù)的真菌CDA都具有一定的熱穩(wěn)定性［12-14，17］，并且是糖蛋白［14-15，17-18］，但是也報(bào)道稱 CDA存在不含糖的活性形式，E.coli中克隆表達(dá)的Saccharomyces cerevisiae CDA2基因時(shí)［16］，發(fā)現(xiàn)純化的重組酶是單體形式，分子量是35kDa，與S.cerevisiae的天然Cda2p去糖基化后的分子量一致，缺少CoCl2的重組酶就會(huì)失活，而CoCl2對(duì)S.cerevisiae的天然酶并不是必需的，只是起激活作用［15］，并且S.cerevisiae的天然Cda2p脫糖基化后完全失活，加入CoCl2后酶活才恢復(fù)；利用質(zhì)譜分析重組 P.pastoris中表達(dá)的C.lindemuthianum UPS9 CDA［19］，發(fā)現(xiàn)其不含糖類，而且不需要糖基化和 Co2+就可以表現(xiàn)出活性，但是Co2+有顯著的激活作用。

表1 不同菌株的甲殼素脫乙酰酶性質(zhì)

在一些體外實(shí)驗(yàn)中，A.coerulea CDA在體外合成可以對(duì)殼聚糖的轉(zhuǎn)化率達(dá)到90%，這與A.coerulea體內(nèi)殼聚糖脫乙酰作用的程度（95%）極為接近，說明此CDA在體外具有很好的轉(zhuǎn)化活性。另外 C. lindemuthianum CDA［20］具有一個(gè)很有趣的性質(zhì)，此CDA在3.0mol/L醋酸鈉存在時(shí)會(huì)乙酰化自由的氨基糖殘基，使之轉(zhuǎn)化為N-乙酰化形式，即通過逆水解反應(yīng)將GlcN2合成GlcNAcGlcN。這為研究酶N-乙?；被翘峁┝艘粋€(gè)新的方法，還可以合成一個(gè)不常見的N-乙酰化的產(chǎn)物（GlcNAcGlcN），同時(shí)這也是對(duì)CDA能力多樣化的一個(gè)重要發(fā)現(xiàn)。

2 真菌CDA在生物體內(nèi)的功能

關(guān)于真菌CDA在生物體內(nèi)的功能研究集中于C.lindemuthianum 和 S.cerevisiae比較多。在 C. lindemuthianum中研究發(fā)現(xiàn)，CDA主要參與病原性入侵的過程，而在S.cerevisiae中CDA主要是參與正確的合成孢子壁中的殼聚糖成分，這說明在不同亞門的真菌中CDA的生物學(xué)功能不同，所以有必要進(jìn)一步的研究CDA在其他亞門中的作用，對(duì)其生物學(xué)功能多樣性做進(jìn)一步的研究。

Iason Tsigos等［14］提出了C.lindemuthianum中的CDA可能在此植物病原菌入侵植物的機(jī)制中起作用。甲殼素寡聚物可以激活植物防御機(jī)制，但是這些寡聚物的脫乙酰形式不具有激活植物防御功能的作用，CDA的作用就是對(duì)這些寡聚物進(jìn)行脫乙酰作用，所以C.lindemuthianum的CDA可能是在胞外將寡聚物轉(zhuǎn)化成其脫乙酰的形式，這樣就可以避免被植物的幾丁質(zhì)酶降解，從而保證真菌順利地侵入植物。此外，與CDA作用的底物只有第二個(gè)GlcNAc糖被脫乙?；?1］，作用后的產(chǎn)物既不能被幾丁質(zhì)酶水解也不能被殼聚糖酶水解。因此 CDA可能是C.lindemuthianum的一個(gè)重要毒性因子，當(dāng) C. lindemuthianum侵入并在宿主組織中繁殖時(shí)，CDA可以偽裝它以免被宿主的多糖酶水解掉。

CDA對(duì)形成正確的S.cerevisiae子囊孢子壁具有重要作用［22］，CDA突變的孢子對(duì)水解酶、乙醚和熱相當(dāng)?shù)拿舾?。S.cerevisiae中有兩個(gè)CDA，即Cda1p和Cda2p，它們只在S.cerevisiae孢子形成期專一性表達(dá)，Cda2p在孢子細(xì)胞壁的脫乙酰作用中起主要作用，而Cda1p可能對(duì)過程起精細(xì)調(diào)控作用。Yasuhiro Matsuo等［23］在Schizosaccharomyces pombe中也報(bào)道了類似現(xiàn)象，破壞編碼CDA的Cda1+基因之后，菌株不能正確的形成孢子，說明S.pombe正確形成孢子需要CDA，這與CDA在釀酒酵母的作用相一致。

3 真菌CDA的基因

關(guān)于CDA基因研究在Saccharomyces cerevisiae［16］、Gongronella butleri［6］、Rhizopus nigricans［8］、Rhizopus circinans［13］、 Colletotrichum lindemuthianum［6，24］、Schizosaccharomyces pombe［23］、甚 至 于 Tribolium castaneum［10］中都有報(bào)道。很多研究都是在E.coli［16，24］和Pichia pastoris［13，19］中克隆表達(dá)重組CDA，并且多個(gè)菌株CDA的cDNA文庫(kù)已經(jīng)構(gòu)建成功［6，8，13］。

在S.cerevisiae中有兩個(gè)CDA基因［16］：CDA1和CDA2，它們?cè)阪咦有纬善诘牟煌瑫r(shí)間限制性表達(dá)。敲除這兩個(gè)基因的細(xì)胞在形成孢子時(shí)沒有CDA活力，這說明酵母中沒有其他的基因編碼CDA。但同時(shí)有另外兩個(gè)基因DIT1和DIT2也在子囊孢子壁形成時(shí)特異性表達(dá)，與CDA基因相似。這說明產(chǎn)孢子特異性基因的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子（包括DIT1和DIT2，IME1和IME2）應(yīng)該在CDA基因的表達(dá)中扮演重要角色。野生型細(xì)胞和一個(gè)△cda被破壞的細(xì)胞在熒光、蝸牛酶敏感性、熱激、乙醚等方面沒有區(qū)別，這意味著一個(gè)CDA基因?qū)ψ阋哉_的形成孢子，但是殘余的CDA活力近似原來的一半。如果兩個(gè)CDA基因都被敲除后，菌株會(huì)對(duì)上述反應(yīng)敏感，并且經(jīng)酶水解后會(huì)失去自然熒光。根據(jù)與M.rouxii的CDA序列相似性對(duì)比，逐步的去除N或C端的保守區(qū)域，發(fā)現(xiàn)去除N端12個(gè)或更多氨基酸會(huì)導(dǎo)致酶活完全喪失，這可能是由于成熟酶N端氨基酸涉及蛋白的正確折疊；去掉C端7個(gè)氨基酸沒有明顯的酶活喪失，去除27個(gè)或更多個(gè)C端氨基酸會(huì)導(dǎo)致酶失活。

C.lindemuthianum CDA的基因開放閱讀框是由一個(gè)N端27個(gè)氨基酸的前序列和成熟CDA組成，成熟酶的氨基酸序列與魯氏毛霉中的CDA有26%是一致的，46%是相似的，由氨基酸序列數(shù)據(jù)推測(cè)的蛋白質(zhì)分子大小為24.3kDa。將此基因克隆至E.coli中［17］，利用S.lividans幾丁質(zhì)酶的信號(hào)肽，蛋白質(zhì)成功的定位于胞外，并且在預(yù)計(jì)的位點(diǎn)被大腸桿菌信號(hào)肽酶切除。生產(chǎn)出活性形式的CDA，并且與原來的酶Km和kcat值相似。盡管Sl-CDA的N端或C端的修飾作用會(huì)導(dǎo)致活力下降，但是沒有觀察到失活或聚合的現(xiàn)象。

對(duì)G.butleri CDA基因的cDNA文庫(kù)整個(gè)基因測(cè)序［6］，發(fā)現(xiàn)其包含一個(gè)1290個(gè)核苷酸的開放閱讀框，可編碼430個(gè)氨基酸殘基，在其中間區(qū)域含有一個(gè)編碼多聚糖脫乙酰酶的核苷酸序列，占整個(gè)基因序列的34%。根據(jù)初級(jí)結(jié)構(gòu)推測(cè)在氨基酸序列中有9個(gè)可能的N端糖基化位點(diǎn)，其中6個(gè)（Asn75，Asn95，Asn157，Asn296，Asn312，Asn341）與Mucor rouxii的CDA相應(yīng)位點(diǎn)一致。為了測(cè)定CDA之間的進(jìn)化關(guān)系，對(duì)八種產(chǎn)CDA菌進(jìn)行了同源進(jìn)化樹分析，發(fā)現(xiàn)CDA形成的簇剛好與真菌的分類相吻合。這說明在不同產(chǎn)CDA的真菌中，各酶雖具有相似的功能但其進(jìn)化關(guān)系不同。測(cè)序R.nigricans中CDA基因的cDNA文庫(kù)［8］，發(fā)現(xiàn)整個(gè)基因包含了一個(gè)1341個(gè)核苷酸的開放閱讀框，可以編碼447個(gè)氨基酸殘基。核苷酸序列中間有一個(gè)編碼保守多聚糖脫乙酰酶的區(qū)域，占總序列的34%，有八個(gè)可能的N端連接的糖基化位點(diǎn)。

從一個(gè)編碼CDA的R.circinans cDNA文庫(kù)［13］中分離出三個(gè)CDA的cDNA（RC，D2和I3/2）并對(duì)其測(cè)序。將其分別克隆進(jìn)P.pastoris的表達(dá)系統(tǒng)中，雖然利用蛋白質(zhì)印跡免疫檢測(cè)發(fā)現(xiàn)所有的重組克隆都分泌重組蛋白，但是只在含有RC片段的培養(yǎng)基上清液中檢測(cè)出酶活。多聚組蛋白標(biāo)記的RC CDA通過一步可再生性過程被純化至電泳純，盡管在重組蛋白的N端含有多聚組氨酸標(biāo)記，純化的蛋白仍具有高的活力。這是首次在同一接合菌中分離多個(gè)可能的CDA，而且發(fā)現(xiàn)R.circinans中可能含有更多的CDA，這也是首次提出真菌CDA可能是由一個(gè)多基因家族編碼。

4 真菌CDA的作用方式和結(jié)構(gòu)機(jī)制

關(guān)于真菌CDA的作用方式的研究和推測(cè)在比較早的時(shí)候就有報(bào)道，利用高效液相色譜和1H核磁共振光譜對(duì)M.rouxii CDA脫乙酰后產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了研究［25］，此M.rouxii CDA對(duì)聚合度小于3的甲殼素寡聚物不能有效地脫乙?；?，只有（GlcNAc）4和（GlcNAc）5完全脫乙?；?，而（GlcNAc）3、（GlcNAc）6和（GlcNAc）7的還原端殘基仍然是完整的。推測(cè)酶是先去除實(shí)驗(yàn)所用甲殼素寡聚物非還原端殘基上的一個(gè)乙?；?，然后進(jìn)一步按順序水解下一個(gè)乙?；?，之后它與底物分離并與另一條甲殼素寡聚物形成活性復(fù)合體。脫乙酰作用的程度依賴于底物的長(zhǎng)度，而對(duì)于（GlcNAc）4和（GlcNAc）5，酶-底物復(fù)合物的幾何構(gòu)型可能更適合CDA對(duì)底物完全脫乙酰化，或長(zhǎng)或短的寡聚物還原端殘基都不能被脫乙?；?。

C.lindemuthianum cDAH［18］含有四個(gè)次級(jí)位點(diǎn)-2，-1，0，+1，其中0位點(diǎn)是催化性位點(diǎn)，次級(jí)位點(diǎn)-2對(duì)GlcNAc單位上N-乙?；R(shí)別作用強(qiáng)烈。利用連續(xù)的分光光度計(jì)法實(shí)驗(yàn)和ESI-MS相結(jié)合，直接分析cDAH作用（GlcNAc）2～6后的產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)這些次級(jí)位點(diǎn)與GlcNAc殘基的作用是從底物的非還原端到還原端進(jìn)行的。其中C.lindemuthianum UPS9 CDA有一個(gè)單核金屬酶的區(qū)域［21］，它含有一個(gè)結(jié)合鋅的保守組氨酸-組氨酸-天冬氨酸三聯(lián)體，此三聯(lián)體與保守的催化堿（Asp）和酸（His）緊密結(jié)合完成酸堿的催化。數(shù)據(jù)表明C.lindemuthianum具有一個(gè)高度保守的底物結(jié)合溝，具有微妙的選擇性，此選擇性可以影響底物的特異性和次級(jí)位點(diǎn)親和性，并且發(fā)現(xiàn)此酶至少要被（GlcNAc）2占據(jù)0和+1次級(jí)位點(diǎn)才具有活性。

5 真菌CDA的應(yīng)用展望

關(guān)于甲殼素脫乙酰酶的研究國(guó)內(nèi)的一些研究人員［26-28］也做出了積極的貢獻(xiàn)。真菌體內(nèi)，CDA在不溶性甲殼素轉(zhuǎn)化成可溶性殼聚糖過程中起主要作用，CDA的存在可以保證病原性真菌成功地入侵植物，CDA在細(xì)胞增殖過程中也起到重要的作用。同時(shí)，由于CDA作用過后形成的殼聚糖具有很大的商業(yè)價(jià)值，使得CDA的工業(yè)化應(yīng)用引起了廣泛的關(guān)注。

關(guān)于真菌CDA的研究可以為工業(yè)化應(yīng)用提供理論依據(jù)，結(jié)合現(xiàn)代生物學(xué)技術(shù)可以產(chǎn)生大量的、不同性質(zhì)的CDA，可以制備新型的殼聚糖聚合物和寡聚物，這對(duì)于生物醫(yī)學(xué)、食品添加劑、醫(yī)藥、天然殺蟲劑、抗菌劑、金屬膠合生物聚合物、化妝品［1］等方面的發(fā)展都有巨大促進(jìn)作用。在食品工業(yè)中，殼聚糖及其衍生物具有很強(qiáng)的抑菌［29-30］、保鮮作用［31-34］，而且對(duì)人體無任何不良作用，是一種理想的保鮮和防腐劑，已廣泛應(yīng)用于鮮魚、水果、蔬菜等生鮮食品和豆制品以及醬油、醋等調(diào)味品的防霉保鮮，并可用作食醋的防沉淀劑，原料糖汁的純化劑，面包和餅干等食品的添加劑。在牙膏、漱口水及口香糖中添加殼聚糖，有預(yù)防牙周炎、除去或減輕口臭的作用。

但是由于此酶的底物范圍較窄［36］，對(duì)于一般不溶性甲殼素的脫乙酰化程度并不高，現(xiàn)階段的研究還處于實(shí)驗(yàn)室階段，需要嘗試一些新的方法促進(jìn)CDA的應(yīng)用，例如尋找底物范圍更廣的產(chǎn)酶菌、固定化［36］、和其他真菌殺蟲劑聯(lián)用［7］、尋找其他更適合工業(yè)化應(yīng)用的菌株（如細(xì)菌）等?，F(xiàn)在關(guān)于CDA的研究主要集中在陸生性真菌和一些病原性真菌中，對(duì)于一些微生物豐富的地方（如沿海地區(qū)）應(yīng)該積極地探索新的產(chǎn)CDA的菌源（如海洋微生物），同時(shí)這些區(qū)域的甲殼素類物質(zhì)較多可直接進(jìn)行商業(yè)化生產(chǎn)和應(yīng)用，減少成本，獲得良好的社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益。

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Progress of research on fungi chitin deacetylase

ZHU Li-ping，HUANG Hui-li*
（College of Chemical Engineering，Huaqiao University，Xiamen 361021，China）

Chitin deacetylase（CDA）is an enzyme that catalyzes the hydrolysis of acetamine groups of N-acetyl-D -glucosamine in chitin，converting it to chitosan.Chitosan is a biopolymer of unique properties which has bright prospects in industries such as food，pharmaceuticals，chemical and so on.lt’s also a good food fiber which regulates certain activities in human body，the application value of chitosan in food and pharmaceutical industry should be given enough attention.The latest advances of CDAs of fungi，including sources，purification and characterization，biological role，genes，mode of action were presented.And the direction of future research was also discussed.

chitin deacetylase；chitin；chitosan

TS201.2+5

A

1002-0306（2010）11-0394-05

2009-09-28 *通訊聯(lián)系人

朱利平（1986-），男，碩士研究生，研究方向：海洋微生物資源在食品方面的應(yīng)用。

福建省自然科學(xué)重點(diǎn)項(xiàng)目基金（2007T010）。