不同補料發酵方式對重組畢赤酵母高密度培養的影響

灑榮波，石貴陽，唐瑜菁

（1.泰山醫學院生物科學系，山東泰安271016；2.江南大學生物工程學院，江蘇無錫214036）

不同補料發酵方式對重組畢赤酵母高密度培養的影響

灑榮波1，石貴陽2，唐瑜菁1

（1.泰山醫學院生物科學系，山東泰安271016；2.江南大學生物工程學院，江蘇無錫214036）

目的：研究5L發酵罐中葡萄糖補料方式對重組畢赤酵母高密度培養的影響，為大規模工業化生產奠定基礎。方法：葡萄糖分批發酵階段結束以后，以不同的流加策略流加補料培養基。結果：分批發酵初始葡萄糖最佳濃度為10g/L；采用間歇補料和恒速流加補料方式培養畢赤酵母，發酵結束后菌體細胞干重分別為33.2g/L和41.5g/L，而采用指數流加補料方式，發酵前期和發酵后期控制比生長速率分別為0.20h-1和0.15h-1，發酵結束后菌體細胞干重可達53.4g/L。結論：采用分階段控制比生長速率的發酵策略，發酵結束后菌體細胞干重遠遠大于間歇補料和恒速流加補料發酵策略。

重組畢赤酵母，高密度培養，補料方式

甲醇營養型巴斯德畢赤酵母是一種具有表達率高、遺傳穩定、產物可分泌等優點的外源分泌蛋白和胞內蛋白表達的一種優秀宿主［1］。它能夠生長在以甲醇作為唯一碳源和能源的培養基上，擁有一條高效誘導的甲醇利用途徑。目前巴斯德畢赤酵母表達系統在國內外的應用非常廣泛，到目前為止，已有數百種外源蛋白在該系統中得到表達［2］。按照Invitrogen公司對畢赤酵母的研究，外源蛋白在畢赤酵母中的表達分兩步，即菌體生長和蛋白誘導表達。先在以甘油或葡萄糖為碳源的培養基中培養菌體，達到一定OD值后無菌離心，收集菌體后在以甲醇為唯一碳源的培養基中進行誘導表達。高密度發酵是基因工程菌提高外源蛋白表達水平的一種重要策略，迄今已有許多蛋白通過高密度發酵獲得高表達量［3-4］。畢赤酵母發酵產物的累積不會對自身產生毒副作用，且畢赤酵母的表達菌株很容易從搖瓶培養擴大到大批量高密度發酵，不影響外源基因的表達水平。這兩點注定了畢赤酵母具有可用于高密度發酵的巨大潛力［5］。筆者選取了一種廉價的工業化培養基，并對其進行優化，使得此培養基在最佳培養條件下生產畢赤氏酵母的生物量達到最大。本文報道了在5L發酵罐中以不同補料方式對重組畢赤酵母高密度發酵的影響，為大規模工業化生產奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

表1 不同葡萄糖初始濃度的動力學參數

巴斯德畢赤氏酵母 pichia pastoris KM71（his4 arg4 aox1∷ARG4） 表達載體pPIC9k為Invitrogen公司產品，外源基因為粗糙脈孢菌（Neurospora crassa）植酸酶基因，載體呈線性整合在染色體上，由江南大學工業生物技術教育部重點實驗室課題組構建；平板保存及活化培養基 YPD固體培養基（葡萄糖2%，蛋白胨2%，酵母膏1%，瓊脂2%，pH自然）；種子培養基 YPD液體培養基（葡萄糖2%，蛋白胨2%，酵母膏1%，pH自然）；發酵基礎培養基 葡萄糖1%，KH2PO40.7%，MgSO4·7H2O 0.03%、FeSO4· 7H2O 0.05%、MnSO4·H2O 0.05%，用25%氨水調節pH為5.5；發酵補料培養基 葡萄糖40%，MgSO4· 7H2O 10g/L；培養基滅菌條件 0.1MPa，121℃下滅菌20min。

1.2 實驗方法

1.2.1 種子活化方法 見參考文獻［2］。

1.2.2 種子培養基的搖瓶培養法 見參考文獻［2］。

1.2.3 葡萄糖分批發酵培養方法 將搖瓶種子按10%接種量接入裝有3L發酵基礎培養基的5L發酵罐中進行發酵，通氣量為1.5vvm，在堿液瓶中加入25%（V/V）濃氨水，發酵過程中培養液pH控制在5.5。空氣流量為1.5vvm，轉速為800r/min時，接種前設定溶氧量（DO）為100%，當初始葡萄糖耗盡后開始流加補料液。

1.2.4 葡萄糖流加方法 在葡萄糖分批發酵階段結束以后，以不同的流加策略流加補料培養基直到菌體培養至所需密度。在此階段，依舊通過流加25%氨水保持pH恒定在5.5，調節通氣量和攪拌轉速使溶氧維持在20%以上。

1.3 分析方法

1.3.1 酵母細胞密度測定 見參考文獻［2］。

1.3.2 菌體生物量的測定 見參考文獻［2］。

1.3.3 葡萄糖濃度的測定 DNS法［6］。

1.3.4 pH的測定 發酵罐pH電極在線檢測。

1.3.5 溶氧（DO）的測定 發酵罐溶氧電極在線檢測。

2 結果與討論

2.1 5L發酵罐分批培養初始葡萄糖濃度的確定

為了獲得更高的葡萄糖細胞得率，必須使初始培養基中的葡萄糖濃度能使培養菌以較快的速度產生菌體，為此進行了葡萄糖初始濃度的搖瓶實驗。實驗結果及動力學參數如圖1及表1所示。從中可以看出，隨著葡萄糖濃度的升高，最終細胞干重（DCW）也隨之增加，但最大細胞生產強度及葡萄糖的細胞得率卻有所不同，葡萄糖濃度為10g/L時的最大細胞生產強度及細胞平均產率最大，30g/L濃度的葡萄糖最大細胞生產強度及細胞平均產率最低。綜合考慮，我們選擇5L罐分批培養時的初始葡萄糖濃度為10g/L。

圖1 不同葡萄糖初始濃度與菌體生長的關系

2.2 生長期碳源葡萄糖補料方式的探索基因工程菌發酵應在保證基因表達的前提下盡量提高菌體密度，這樣才能提高工作效率以利于后期的分離、純化［7］。在分批培養的生長期進行流加補料可實現畢赤酵母工程菌的高密度培養，為產酶期提高植酸酶表達分泌水平奠定堅實基礎。我們實驗了生長期葡萄糖的不同流加方式對工程菌生長的影響。

2.2.1 間歇補料發酵 間歇補料是一種常見的流加發酵方式，實驗中補料量70mL/次，64h結束發酵，總共補料量為560mL葡萄糖，折合葡萄糖224g，實驗過程的動力學曲線如圖2所示。從圖中可以看出，隨著發酵進行，補料開始時剩余葡萄糖量隨之增多。考慮到補料量及菌體培養的經濟性，我們選擇在64h時停止發酵，最終達到的酵母細胞干重為33.2g/L。

圖2 間歇補料發酵的動力學曲線

2.2.2 恒速流加補料發酵 實驗中在分批發酵結束后，以5mL·L-1·h-1的恒定速率流加補料液，每4h取樣測定發酵液中的殘糖濃度及菌體密度，56h時補料結束，共補料600mL，折合葡萄糖240g。實驗過程的動力學曲線如圖3所示。從圖中可以看出，補料開始后的24h內，菌體密度增加較快，細胞干重基本上呈線性增加，補入的葡萄糖也全部耗盡，發酵液中的殘糖基本維持在0.2g/L附近；補料24h之后，發酵液中的殘糖濃度開始增加，隨著補料時間的延長，殘糖濃度越來越高，在56h時殘糖已高達2.8g/L，因此此時停止補料，發酵結束，最終細胞干重可達41.5g/L。

圖3 恒速補料發酵的動力學曲線

2.2.3 指數流加發酵 Yee L［8］認為目前最成功的基因工程菌高密度培養的方法是指數流加法。理想的微生物生長是菌體量相對時間以指數函數增加，故可以使流加物料量以時間的指數函數增加。指數流加進料速率與時間的關系為

式（1）中，F（t）為t時刻葡萄糖的流加速率，L·h-1；V0為補料開始時刻的發酵液體積，L；X0為補料開始時的菌體濃度，g·L-1；μset為設定的比生長速率，它要滿足的一個條件是：μset＜μmax；YX/S為菌體對底物的得率系數；t是發酵時間，h；SF是流加葡萄糖的濃度，g·L-1；S是罐內葡萄糖的濃度，g·L-1。實驗中V0=3L，X0=4.1g·L-1，YX/S由分批發酵數據計算為0.41g·g-1，SF=400g·L-1。通過流加發酵動力學模型對畢赤酵母分批發酵的菌體生長曲線進行擬合，得到菌體生長動力學模型為：

式（2）中X為菌體濃度，g·L-1，t是發酵時間，h。該模型能夠很好地擬合菌體對數生長期和穩定期的變化趨勢，回歸的R2值為0.997，結合菌體生長動力學模型計算求得實驗最大比生長速率 μmax= 0.385h-1，原則上只要我們所取的μset值小于0.385h-1就可以了，實驗中初步設定μset=0.15h-1。指數流加補料的動力學曲線如圖4所示。

圖4 指數流加補料的動力學曲線（μset=0.15h-1）

從圖中可以看出，指數流加補料開始之后，發酵液中的葡萄糖濃度一直維持在0水平，說明加入的葡萄糖被完全消耗，DO值也在發酵全過程保持在20%以上，發酵進行到52h時停止補料，此時細胞干重達到最高為39.7g/L。由于實驗所設定的μset在較低的0.15h-1，補入的葡萄糖很快被酵母利用，畢赤酵母的生長仍處于葡萄糖限制生長的狀態，三羧酸循環的周轉能力還沒有達到飽和狀態。如果畢赤酵母攝入的底物過多，比生長速率大于一定的閾值后很容易積累乙醇，這個閾值一般在0.14～0.5h-1范圍內［11］，因此本實驗所設定的比生長速率是較為保守的。

為了確定最佳的比生長速率，我們又進行了一次μset=0.20h-1的實驗，實驗結果如圖5所示。從圖中可以看出，當我們提高了比生長速率后，葡萄糖的流加速率也相應隨之增加，52h結束發酵時，最大細胞干重為44.1g/L。整個過程流加了葡萄糖補料液800mL，但所得到的菌體干重卻僅為μset=0.15h-1時的1.2倍，沒有明顯的增加。從圖中的DO曲線可以看出：在發酵的前36h，發酵液中的DO值可以保持在20%以上，但36h（此時已補料20h）以后，DO值持續下降，40h已下降到12%，48h的DO值已接近為0，說明此時的細胞生長旺盛，需氧較多，單純依靠提高攪拌轉速與通氣量已不能滿足DO值大于20%，此時葡萄糖已有一部分進入了厭氧發酵途徑，而沒有用來生長菌體，從而造成了葡萄糖的浪費。

圖5 指數流加補料的動力學曲線（μset=0.20h-1）

為了達到更高的菌體密度，實驗中我們采取這樣一種補料策略：為了讓酵母生長更快一些，我們可以采用分階段設定比生長速率的方法來進行畢赤酵母的上罐發酵。在指數補料階段的前20h，我們可以設定 μset=0.20h-1；而在 20h以后，設定 μset= 0.15h-1。這樣可以在補料前期不影響酵母菌體的生長，而在補料后期又不會造成酵母生長過于旺盛、溶氧太低而進行厭氧發酵。驗證實驗如圖所示。

圖6 指數流加補料的動力學曲線（分階段控制比生長速率）

實驗結果達到了本實驗的預期目的，整個發酵過程的DO值一直控制在20%以上，補料階段的殘糖濃度也一直維持在0水平，最終達到53.4g/L的菌體密度，比前兩次指數流加實驗都有所提高。

3 討論

在本文中，我們通過在指數流加過程中分階段設定不同的比長速率來控制葡萄糖的流加速率，使發酵液中的碳源濃度維持在接近0的水平，可維持較高的溶氧水平，很好地解決了發酵進行到36h時溶氧水平降為0的矛盾。實驗中由于上罐次數的限制，僅實驗了比生長速率分別為0.15h-1和0.20h-1，旨在發現其中規律。根據所建立的動力學模型，提出了分階段控制比生長速率的方法，發酵前20h和20h以后控制比生長速率分別為0.20h-1和0.15h-1，最終菌體細胞干重達到53.4g/L，比控制恒定比生長速率時的菌體細胞干重有所提高。

［1］郭美錦，吳康華，杭海峰，等.基因工程菌Pichia pastoris高密度培養條件研究［J］.微生物學通報，2001，28（3）：6-11.

［2］Romanos M A，Scorer C A，Clare J J.Foreign gene expression in yeast：a review［J］.Yeast，1992，8（6）：423-488.

［3］林俊涵.畢赤酵母高密度發酵工藝的研究［J］.中國生物工程雜志，2009，29（5）：120-125.

［4］竇燁，王清路，李俏俏.畢赤酵母工程菌發酵條件的優化［J］.食品工業科技，2008，29（6）：168-171.

［5］李洪淼，王紅寧，許欽坤.畢赤酵母高密度發酵研究進展［J］.生物技術通訊，2005，16（2）：210-212.

［6］張惟杰.糖復合物生化研究技術［M］.杭州：浙江大學出版社，1994：168-169.

［7］李寅，陳堅，周楠迪，等.環境條件及搖瓶補糖策略對谷胱甘肽發酵的影響［J］.生物工程學報，1998，14（2）：147-152.

［8］Yee L，Blanch H W.Recombinant trypsin production in high cell density fed-batch cultures in Escherichia coli［J］.Biotechnol Bioeng，1993，41（8）：781-790.

［9］俞俊棠，顧其豐，葉勤.生物化學工程［M］.北京：化學工業出版社，1994：90-91.

［10］Gu M B，Park M H，Kim D I.Growth Rate Control in Fed-Batch Culture of Recombinant Saccharomyces cerevisiae Producing Hepatitis B Surface Antigen（HBs Ag）［J］.Appl Microbiol Biotech，1991，35：46-50.

［11］Paalme T，Tiisma K，Kahru A，et al.Glucose-limited fedbatch cultivation of Escherichia coli with computer-controlled fixed growth rate［J］.Biotechnology and Bioengineering，1990，35：312-319.

Influence of different feeding strategies on high density culture of recombinant pichia pastoris

SA Rong-bo1，SHI Gui-yang2，TANG Yu-jing1
（1.Bioscience Department，Taishan Medical University，Taian 271016，China；2.School of Biotechnology，Jiangnan University，Wuxi 214036，China）

Objcetive：To develop the influence of three different feeding strategies on high density culture of recombinant pichia pastoris.Method：Medium was fed in different feeding strategies after batch fermentation ended.Results：The optimum concentration for glucose was 10g/L in batch fermentation.The dry cell weight were 33.2g/L and 41.5g/L respectively in intermission and constant velocity fed-batch fermentation.When the specific growth rate was controlled 0.20h-1and 0.15h-1prophase and anaphase of the fermentation，the dry cell weight in exponential fed-batch processes was 53.4g/L.Conclusion：The dry cell weight with different specific growth rate was higher than the other two fermentation strategies.

recombinant pichia pastoris；high density culture；feeding strategy

TS201.3

A

1002-0306（2010）11-0210-04

2009-11-04

灑榮波（1978-），男，講師，碩士，研究方向：微生物發酵。

泰山醫學院青年科學基金項目（2008-2009）。