兩種不同離子層析法分離雞蛋溶菌酶的比較研究

張新寶，陳紅兵，高金燕

（1.南昌大學食品科學與技術國家重點實驗室，江西南昌330047；2.南昌大學中德聯合研究院，江西南昌330047；3.南昌大學食品系，江西南昌330047）

兩種不同離子層析法分離雞蛋溶菌酶的比較研究

張新寶1，2，陳紅兵1，2，高金燕1，3，*

（1.南昌大學食品科學與技術國家重點實驗室，江西南昌330047；2.南昌大學中德聯合研究院，江西南昌330047；3.南昌大學食品系，江西南昌330047）

以雞蛋溶菌酶的主要分離方法—陽離子交換法與陰離子交換法為對象，從分離的回收率、雞蛋溶菌酶純度以及樣品處理周期等方面進行比較研究。研究結果顯示，兩種方法均能較好地分離雞蛋溶菌酶。陰離子交換法分離出的雞蛋溶菌酶純度更高，純度＞90%，并且分離周期短，操作更方便，但其回收率為20.7%，而陽離子交換法的為31.1%，陰離子交換法更適合于制備高純度的蛋清溶菌酶。

溶菌酶，離子層析，分離純化

雞蛋溶菌酶因其天然的殺菌抑菌作用而作為一種食品防腐劑被廣泛應用于各類食品行業之中，并且，它僅由一條多肽鏈組成，結構相對簡單，歷來作為一種模式蛋白被用來研究蛋白質的結構和功能，因此，雞蛋溶菌酶分離純化工作一直不斷受到許多科研工作者的青睞。雞蛋溶菌酶（Lysozyme，EC3.2.1.17），又稱N-乙酰胞壁質酶，是一種專門作用于革蘭氏陽性菌細胞壁的水解酶，由129個氨基酸殘基構成，其分子量約為14.3kDa。因雞蛋溶菌酶含有大量的組氨酸、精氨酸、賴氨酸、谷氨酰胺以及天冬氨酸等堿性氨基酸，其等電點pI為10.7，為典型的堿性蛋白質，在酸性或近中性環境中帶有大量的正電荷，能選擇性吸附在陰離子交換分離介質上，從而與蛋清中其他蛋白質分離開來。因此，陽離子交換法在分離雞蛋溶菌酶上更容易受到關注，其中已有大批科研工作者從分離介質的選擇、不同因素對雞蛋溶菌酶分離效果的影響、工藝過程控制等方面對陽離子交換法做了深入研究［1-6］，尤其以Xue等人研究得出的分離條件較為成熟［7］。另外，還有極少數文獻報道使用陰離子交換樹脂分離溶菌酶。來自吉林大學的李欣使用DEAE-纖維素陰離子交換柱法分離蛋清溶菌酶，以pH10.0的Tris緩沖液作為洗脫液［8］。但至今還未見有文獻報道比較研究以上兩種分離方法的優劣之處，因此，本研究在參考相關文獻報道的基礎上，分別對這兩種分離方法進行改進，進而比較研究它們在分離雞蛋溶菌酶上的分離效果。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鮮雞蛋 購于市場；雞蛋溶菌酶標準品 電泳純級，sigma公司；牛血清白蛋白 電泳純，中國醫學科學院血液學研究院；其他常用生化試劑 分析純。

柱材CM-葡聚糖陽離子凝膠樹脂、DEAE-葡聚糖陰離子凝膠樹脂 法碼西亞公司；恒流泵HL-2、自動部分收集器BSZ-160、TH-500A梯度混合器上海青浦滬西儀器廠；HD-93-1型紫外檢測儀 上海金達生化儀器廠；垂直電泳系統、凝膠成像系統Bio-Rad公司；TU-1901雙光束紫外可見分光光度計北京普析通用儀器有限公司；分蛋器。

1.2 實驗方法

1.2.1 蛋清預處理 取新鮮雞蛋，先洗凈，在蛋殼一端破殼，分蛋器分離蛋清，加入等體積的蒸餾水，輕輕攪拌均勻，以不起氣泡為宜，再用三層紗布過濾不溶物，調節蛋清濾液 pH至6.1，4℃冰箱靜止5h，3000r/min離心5min，過濾除去沉淀物，再調pH至4.5，同樣條件下靜止5h，過濾除去沉淀物，將濾液放于-20℃冰箱內備用。

1.2.2 CM-陽離子交換法分離溶菌酶 參照Timothy D等人的實驗方法［4］，對其稍作改進。首先將CM-葡聚糖凝膠G-50經酸、堿預處理，裝柱，水洗至中性，然后用濃度為0.05mol/L、pH7.0的磷酸鹽緩沖液平衡3～4h，直至核酸蛋白檢測儀數值穩定下來，然后上樣5mL，再用含0.5mol/L NaCl的上述磷酸鹽緩沖液進行梯度洗脫，控制流速為1.5mL/min，依據記錄儀記錄下的洗脫峰收集洗脫液，-20℃冰箱保存備用。

1.2.3 DEAE-陰離子交換法分離溶菌酶 經過預處理的DEAE-葡聚糖凝膠裝柱后，先用蒸餾水洗至中性，然后用pH7.5的Tris緩沖液平衡3～4h至核酸蛋白檢測儀數值恒定，經調零后，上樣5mL，繼續用上述Tris緩沖液，采用與步驟1.2.2相同的流速條件進行洗脫，待穿過峰洗脫下來后，立即改用含1.2mol/L NaCl的Tris緩沖溶液進行洗脫，收集穿過峰對應的洗脫液，-20℃冰箱保存備用。

1.2.4 SDS-PAGE鑒定蛋白成分及純度 參照《生物化學實驗原理與方法》，通過SDS-PAGE電泳鑒定上述兩種分離法分離得到的樣品中蛋白成分。本實驗采用15%的分離膠和5%的濃縮膠，使用考馬斯亮藍法染色，以標準蛋白maker（11～170kDa，Sigma）確定蛋白質分子量，同時與1mg/mL的溶菌酶標準品做電泳比對，確定分離樣品的純度。

1.2.5 溶菌酶回收率的測定 參照Folin-酚法，分別測定兩種方法分離得到的樣品中蛋白質濃度，計算蛋清溶菌酶回收率。以牛血清白蛋白作為標準蛋白制定標準曲線。

2 結果與分析

2.1 CM-陽離子交換法分離溶菌酶

CM-陽離子交換法分離雞蛋蛋清溶菌酶如圖1（A）所示。該方法將蛋清蛋白分離為三個峰，它們之間都有一定的間隔，說明后面的兩種蛋白質得到了很好的分離，從后面的SDS-PAGE電泳實驗結果（圖2）得知，峰Ⅲ對應的樣品為溶菌酶，計算其分離度R=2.53，說明CM-陽離子交換法能夠將雞蛋溶菌酶很好地分離開來。

圖1 離子交換法分離雞蛋溶菌酶洗脫曲線

2.2 DEAE-陰離子交換法分離溶菌酶

圖1（B）所示為陰離子交換法分離溶菌酶的洗脫曲線，從圖可以看出，雞蛋蛋清蛋白僅被分離為峰Ⅰ和峰Ⅱ兩部分，它們之間間隔顯著，其分離度R= 4.4，也說明這兩種蛋白質被充分的分離開來。圖2的電泳結果顯示峰Ⅰ對應的樣品為蛋清溶菌酶。通過A、B兩條洗脫曲線，我們可以看出，使用陰離子交換法僅需要30體積的洗脫液就能夠將雞蛋溶菌酶從蛋清蛋白中分離開來，較陽離子交換法少用大約15體積的洗脫液，既省時，又省料。

2.3 SDS-PAGE鑒定蛋白質成分

圖2為SDS-PAGE電泳圖。與蛋白marker相比較，陽離子交換法中峰Ⅲ和陰離子交換法中的峰Ⅰ對應的樣品D1、D2在電泳泳道的下部都出現了一清晰的條帶，蛋白質分子量約為14kDa，可以確定該蛋白質為雞蛋溶菌酶。與電泳純溶菌酶標準品S（純度＞90%）相比較，陰離子交換法分離得到的樣品D1中僅含有一個條帶，可以說明該方法分離得到的雞蛋溶菌酶純度＞90%，而用陽離子交換法分離得到的樣品D2經SDS-PAGE電泳后，泳道中還出現了一條暗淡的條帶N，說明其中還含有少量的雜質。因此，陰離子交換法分離得到的樣品純度更高。

2.4 溶菌酶回收率

兩種方法分離得到的蛋清溶菌酶樣品的蛋白濃度及蛋清溶菌酶回收率如表1所示。雞蛋溶菌酶約占蛋清總蛋白的3.4%［9］，以此為依據計算得這兩種方法分離得到的蛋清溶菌酶的回收率分別達31.1%和20.7%，高于Xue等人所得實驗數據20%。

表1 兩種離子交換所得雞蛋溶菌酶回收率對照表

圖2 SDS-PAGE電泳圖

3 討論

研究結果顯示，這兩種蛋清溶菌酶的分離方法都取得了較好的分離效果。對比Xue等人的洗脫曲線（圖1 C），這兩種方法分離得到的洗脫峰比較集中，洗脫體積小，省時又省料，并且分離出的洗脫峰少，僅僅是將蛋清溶菌酶分離開來，雜蛋白基本都集中在一起，有利于其他雜蛋白的再利用，提高資源利用率，非常適合于雞蛋溶菌酶的工業化生產。

但是對比研究這兩種分離方法會發現，它們的分離效果仍然有很大差別。雖然陽離子交換法也能夠將蛋清溶菌酶與其他雜蛋白分離開來，但是從圖2可以發現，其中仍然含有少量的雜蛋白，這與Xue等人采用陽離子交換法粗分離蛋清溶菌酶得到的結果一致，其中的原因可能是蛋白與分離介質之間不僅有正負離子的相互作用，還有一定的范德華力，使得少量雜蛋白不能經磷酸鹽緩沖液完全洗脫下來，而在后來的鹽離子競爭作用下隨溶菌酶一起洗脫下來。陰離子交換法分離溶菌酶曲線顯示，蛋清溶菌酶的分離度R=4.4，遠大于陽離子交換法的分離度，并且陰離子交換法分離得到的溶菌酶通過SDS-PAGE電泳檢驗并未發現有雜蛋白，說明其純度較陽離子交換法有明顯提高，接近或超過電泳純級蛋清溶菌酶標品的純度（＞90%）。另外，從兩種離子層析洗脫曲線上，我們也可以看出陰離子交換法的樣品分離周期更短，僅為陽離子交換法的66.7%左右。

在計算雞蛋溶菌酶回收率時，我們以Stevens等人報道雞蛋溶菌酶占蛋清總蛋白的比例為依據粗略計算出其回收率［9］。計算結果表明，陽離子交換法制備的溶菌酶回收率要高于陰離子交換法，究其原因，陽離子交換介質幾乎吸附了蛋清上樣液中所有的雞蛋溶菌酶，在后來的高鹽離子競爭作用下被完全洗脫下來；而用陰離子交換介質分離時，有部分溶菌酶通過分子間范德華力被吸附在分離介質上沒有隨穿過峰一起洗脫下來，而在隨后的介質再生過程中與雜蛋白一起被洗脫下來，致使部分雞蛋溶菌酶損失，故其回收率遠低于陽離子交換法的31.1%，但仍與Xue等人報道的20%的回收率基本一致。

總結以上兩種分離方法，我們可以發現，陰離子交換法程序相對簡單、洗脫時間短、蛋白純度高，更適合于制備高純度的蛋清溶菌酶。

［1］常凱，邸海洋，何昭陽.溶菌酶的提取及其在焙烤食品中的應用［J］.食品科技，2008（10）：167-169.

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［7］Xue Q G，Schey K L，Volety A K，et al.Purification and characterization of lysozyme from plasma of the eastern oyster（Crassostrea virginica）［J］.Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol，2004，139（1）：11-25.

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Comparison of two different ion chromatography methods in purification of egg white lysozyme

ZHANG Xin-bao1，2，CHEN Hong-bing1，2，GAO Jin-yan1，3，*
（1.State Key Laborary of Food Science and Technology，Nanchang University，Nanchang 330047，China；
2.Sino-German Joint Research Institude，Nanchang University，Nanchang 330047，China；3.Department of Food Science，Nanchang University，Nanchang 330047，China）

Anion chromatography and cation chromatography，which were the major methods in separating egg lysozyme，were investigated to compare their difference in the recovery rate，the resulting purity of lysozyme，and the time needed in separating the samples.Results showed both of the two methods could separate egg white lysozyme effectively.Specifically，the result of anion chromatography showed a higher purity，which was more than 90%.And it was also much more convenient and time-saving.However，the recovery rate was 20.7%，less than that of cation chromatography which was 31.1%.So anion chromatography was more preferable to purify egg white lysozyme with high purity.

lysozyme；ion chromatography；purification

TS201.2+5

B

1002-0306（2010）11-0283-03

2009-10-26 *通訊聯系人

張新寶（1980-），男，碩士研究生，研究方向：食品營養與安全。

教育部新世紀優秀人才支持計劃（NCET-08-07-04）；江西省自然科學基金（2008GZN0040）；南昌大學食品科學與技術國家重點實驗室自由探索項目（SKLF-TS-200820）。