乙酰肝素酶在妊娠期高血壓疾病大鼠腎臟的表達及低分子量肝素干預治療

屈微 張延麗

(山西醫科大學第一臨床醫院婦產科 山西 太原 030001)

妊娠期高血壓疾病是妊娠期特有的疾病,該病嚴重影響母嬰健康。目前認為由高血壓狀態導致的全身及腎內多種細胞因子、血管活性物質等的改變在妊娠期高血壓疾病中起著關鍵作用,這些異常改變導致多器官系統的損害(如腎臟、肝臟、心臟等),其中腎功能損害是其早期發病特征。發生機制尚不清楚,近年來研究發現細胞外基質(ECM)合成和降解失衡是各種原發性腎病或者繼發性腎病發生、發展的重要原因。乙酰肝素酶(HPA)作為細胞外基質的降解酶,其表達變化可能是妊娠期高血壓疾病腎臟損害的重要原因。

臨床上無特效治療妊娠期高血壓疾病腎臟損害的藥物,有使用肝素治療的經驗,但由于肝素易導致出血,故臨床無推廣,低分子量肝素(LMWH)是從普通肝素中提取出來的,具有出血副作用較少,生物利用度較高等特點,生物作用主要為抗凝、擴張血管、降低血壓、減少腎小球基底膜細胞的增殖、降低尿蛋白等。

本實驗通過制備妊娠期高血壓疾病動物模型并用LMWH進行干預治療,觀察HPA在妊娠期高血壓疾病大鼠腎臟組織中的表達變化及LMWH的治療作用,并探討妊娠期高血壓疾病腎臟損害機制。

1 資料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 實驗動物 wistar大鼠45只,均為12～14周齡(山西醫科大學動物實驗中心提供),用亞硝基左旋精氨酸甲酯(L-NAME)造妊娠期高血壓疾病模型。

1.1.2 主要試劑 亞硝基左旋精氨酸甲酯(L-NAME)(sigma公司)、低分子量肝素鈣注射液:6000IU/0.6mL、兔抗鼠乙酰肝素酶多克隆抗體、即用型鏈酶親和素-生物素-過氧化物酶復合物(SABC)試劑盒,二氨基聯苯胺(DAB)顯色試劑盒,磷酸鹽緩沖液(PBS,0.01mol/L,pH7.4),枸櫞酸鹽抗原修復液(0.01mol/L,pH6.0)(武漢博士德公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 模型建立 體重為250～400g、12～l4周齡的wistar雌性大鼠,按雌雄2:1合籠,每日清晨取雌鼠陰道分泌物涂片,發現精子計為妊娠第1天。將妊娠鼠隨機分為3組,每組15只。妊娠14d皮下注射L-NAME250mg/kg/d,建立妊娠期高血壓疾病模型組；妊娠14d皮下注射L-NAME(上午)同期皮下注射低分子量肝素(下午)600IU/kg建立低分子量肝素干預組；正常妊娠組注射等量的生理鹽水作為對照。3組均于妊娠第12天起每日測量大鼠尾動脈血壓,隔日收集24h尿量測定尿蛋白。

1.2.2 標本收集 于妊娠21d將3組大鼠用1%戊巴比妥鈉麻醉后行剖腹產手術,取出腎臟組織,立即用生理鹽水洗凈,10%甲醛固定24h,石蠟包埋切片,厚4μm,免疫組織化學SABC法染色。

1.2.3 免疫組織化學染色 腎臟組織標本固定48h,常規脫水石蠟包埋,4um厚切片。將組織切片與兔抗鼠乙酰肝素酶抗體共孵化,4℃過夜,生物素標記的羊抗兔免疫球蛋白G(IgG)處理后,滴加SABC,DAB顯色,蘇木素輕度復染,脫水、透明、封片。用PBS替代一抗做陰性對照,陽性組織呈棕黃色,陰性組織呈藍色。結果判斷標準:在放大400倍下,每張切片隨機選取5個視野,并用計算機圖像分析系統軟件計算其陽性區染色的光密度值(OD)進行半定量分析,求其OD均值作為陽性表達的比較值。

1.3 統計學方法

2 結果

2.1 實驗室檢查結果

妊娠期高血壓疾病大鼠于用藥第2天開始即出現高血壓、蛋白尿,結束分娩時伴有胎兒宮內發育遲緩等一系列病理學變化,與人類妊娠期高血壓疾病的癥狀相似。妊娠期高血壓疾病組大鼠的平均動脈壓、尿蛋白明顯高于正常妊娠組,2組比較有統計學意義(P<0.01)；而低分子量肝素干預組與妊娠期高血壓疾病組相比,可見平均動脈壓、尿蛋白顯著降低,2組比較有統計學意義(P<0.01),但仍高于正常妊娠組水平,與正常妊娠組比較有統計學意義(P<0.01)(表1)

2.2 免疫組織化學結果

在妊娠期高血壓疾病組中,乙酰肝素酶在腎小球中表達較正常妊娠組明顯增強,2組比較有統計學意義(P<0.01)。在低分子量肝素干預組中,乙酰肝素酶在腎小球中的表達較妊娠期高血壓疾病組明顯減弱,2組比較有統計學意義(P<0.01)；仍較正常妊娠組的表達增強,與正常妊娠組比較無統計學意義(P＞0.05)(表2)。

3 討論

乙酰肝素酶(HPA)是一種葡萄糖醛酸內切酶,于D-葡萄糖醛酸和N-乙酰葡萄糖苷結合部位切斷硫酸乙酰肝素(HS)側鏈,使HS長鏈逐段分解,釋放多種與HS結合的活性因子如:堿性成纖維生長因子-2及其受體、血小板源性生長因子,抗凝血酶Ⅲ,肝細胞生長因子等,產生一系列生物反應[1]。細胞外基質主要成分中包含蛋白多糖及糖胺多糖,其主要成分是硫酸乙酰肝素蛋白多糖(HSPG)[2],是一種蛋白聚糖類碳水化合物,由一個核心蛋白通過糖苷鍵和數個與之共價連接的HS側鏈組成。HSPG廣泛存在于有脊椎動物和無脊椎動物組織ECM和細胞表面,它能與細胞表面及ECM中的活性分子結合,粘附于細胞表面,是ECM聚集和穩定的基礎[3]。HS是HSPG的側鏈,其N-和O-特異性硫酸化不但賦予HS高密度的負電荷,而且賦予HS與其它細胞外基質和生長因子相互作用的能力[1～2]。HPA能夠切斷細胞表面和細胞外基質中HSPGs上的HS側鏈。

ECM構成腎小球基底膜(GBM)的基本網絡狀框架結構。蛋白尿的發生取決于腎小球濾過和腎小管重吸收,主要與腎小球的濾過功能有關。腎小球濾過膜由內皮細胞層、GBM和足細胞及其裂孔隔膜共同組成,GBM是其中重要的一層,對分子的濾過依賴于分子的大小、形狀及所帶的電荷,其多陰離子位點已被陽離子探針所證實。乙酰肝素酶(HPA)是目前發現唯一能夠降解ECM中主要成分硫酸乙酰肝素蛋白多糖(HSPG)的蛋白水解酶。HPA在正常大鼠腎臟的腎小球不表達,而小管上皮細胞呈低表達[4]。在出現大量蛋白尿時尿液中HS含量明顯增加[5]。蛋白尿的發生與GBM中HS側鏈的減少有關,已經證實在不同的人類蛋白尿性腎小球疾病,如:系統性紅斑狼瘡腎炎、微小病變腎小球病、膜性腎病以及糖尿病腎病等GBM中HS的染色減少[6]。而隨著對蛋白尿發生機制的深入研究,人們發現在病理狀態下腎臟HPA的表達增高,突出表現在腎小球HPA的表達變化,說明HPA維持正常腎小管細胞的黏附與轉歸,而腎小球表達增高可能通過降解腎小球基底膜上的HS側鏈,導致ECM和基底膜結構破壞,從而產生蛋白尿。腎臟組織中乙酰肝素酶的表達與妊娠期高血壓疾病腎臟損害的發生發展有關。

表1 各組大鼠結束分娩時平均動脈壓和尿蛋白

表2 各組腎臟組織乙酰肝素酶陽性反應光密度值

LMWH可顯著降低蛋白尿排泄率[7]。可能與以下機制有關:抑制HPA活性,進而抑制HPA降解HS側鏈,保護ECM和基底膜結構免受破壞；改善基底膜電荷屏障損傷,防止尿蛋白漏出；腎小球基底膜具有肝素受體,低分子肝素可能直接與該受體結合,代替HS發揮負電屏障作用阻止帶負電荷的蛋白由基底膜漏出[8]。低分子量肝素對妊娠期高血壓疾病腎臟損害具有一定的防治作用。

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