Glut-1、VEGF在胰腺癌中的表達(dá)及意義①

楊兵 陳炯

(安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院普通外科 安徽 合肥 230001)

胰腺癌是常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一,惡性程度極高,預(yù)后極差。在腫瘤病理中,細(xì)胞對低氧的適應(yīng)和血管生成是腫瘤發(fā)展過程中的關(guān)鍵步驟之一。本研究通過采用RT-PCR及免疫組織化學(xué)染色的方法檢查胰腺癌及正常人類胰腺組織中血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)和葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白-1(glucose transporter-1,Glut-1)的表達(dá),探討其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料

胰腺癌組:我院普外科2000年1月至2008年10月間手術(shù)切除的30例胰腺癌標(biāo)本;正常組:20例正常胰腺組織來源于同期良性胰腺腫瘤切除距腫瘤邊緣2cm的正常組織,所有標(biāo)本均在手術(shù)切除后迅速凍存于液氮中,然后置于-80℃低溫保存。全部病例術(shù)前均未行放、化療,術(shù)后均經(jīng)病理檢查證實。

1.2 主要試劑

免疫組化SP試劑盒,兔抗人抗體Glut-1、VEGF購自北京博奧森公司;Trizol試劑購自美國invitrogen公司。MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶及TaqDNA聚合酶均購自美國Promega公司;Glut-1、VEGF和βactin引物序列由上海“生工”公司合成,由Primer.5.0軟件設(shè)計,其余試劑均為國產(chǎn)分析純試劑。免疫組化按試劑盒說明書操作。

1.3 RT-PCR檢測

樣品總RNA的制備:取組織50mg,采用Trizol說明書提取其中的總RNA。紫外分光光度計檢測其濃度和純度后,逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。cDNA的合成:反應(yīng)體系中加入提取的RNA5μg,2.5mmol/L脫氧核糖核苷三磷酸(dNTP)4μL,寡聚脫氧胸苷酸0.3μg,RNA酶抑制劑20U,0.1mol/L巰基乙醇25μL,加水至19μL。上述混合物70℃加熱5min后,冰上冷卻,然后加入MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶5μL,終體積25μL,離心、混勻后37℃水浴60min,最后90℃滅活逆轉(zhuǎn)錄酶活性,冰上冷卻后即完成cDNA的合成。利用PCR方法擴(kuò)增模板cDNA,預(yù)變性:94℃ 5min,變性:92℃ 30s,退火:63℃ 30s,延伸:72℃ 45s。循環(huán)次數(shù):35次,后延伸:72℃ 7min。VEGF:上游引物序列5'-GGAGCTTCAGGACATTGCTGTG-3'下游引物序列5'-GGAGGAAGGTCAACCACTCAC-3',目的片段長度為353 bp,Glut-1上游引物序列5'-TCATCGTGGCTGAACTCTTCAG-3'下游引物序列5'-TCACACTTGGGAATCAGCCCC-3',目的片段長度為231bp.β-actin上游引物序列為:5'-ACC ACA GTCCAT GCC ATC AC-3',下游序列為:5'-TCC ACC ACC CTGTTG CTG TA-3',目的片段長度為619 bp,反應(yīng)完畢后,產(chǎn)物取2μL行凝膠電泳。目的基因和內(nèi)參標(biāo)基因(β-actin)PCR產(chǎn)物用凝膠電泳分離,每條帶特異片斷的相對量用DR2000凝膠圖像分析系統(tǒng),在紫外燈下對凝膠圖像進(jìn)行掃描后處理數(shù)據(jù),Marker對照。以目的基因條帶光密度值與β-actin條帶光密度值作為目的基因在胰腺組織和胰腺癌組織中表達(dá)的相對強(qiáng)度。

表1 Glut-1 mRNA、VEGF mRNART-PCR產(chǎn)物光密度測量結(jié)果()

表1 Glut-1 mRNA、VEGF mRNART-PCR產(chǎn)物光密度測量結(jié)果()

注:與正常組比較*P<0.01

表2 Glut-1、VEGF免疫組化結(jié)果()

表2 Glut-1、VEGF免疫組化結(jié)果()

注:與正常組比較，*P<0.01

1.4 免疫組化法檢測蛋白的表達(dá)

胰腺組織石蠟切片Glut-1、VEGF免疫組織化學(xué)染色。每例均隨機(jī)觀察10個高倍視野,讀取陽性細(xì)胞數(shù)。由兩位病理科醫(yī)師雙盲閱片。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 10.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理,所有計量資料均以（）表示。2個樣本均數(shù)間比較用t檢驗。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Glut-1 mRNA、VEGF mRNA在組織中表達(dá)結(jié)果

1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定,正常組Glut-1 mRNA、VEGF mRNA產(chǎn)物電泳條帶暗、產(chǎn)量低;胰腺癌組產(chǎn)物條帶強(qiáng)、產(chǎn)量高,其光密度值與正常組相比明顯增高(P＜0.01)。結(jié)果見表1。

2.2 Glut-1、VEGF的免疫組化結(jié)果

正常組個別細(xì)胞胞漿和/或胞膜內(nèi)Glut-1、VEGF弱陽性表達(dá);胰腺癌組細(xì)胞胞漿和/或胞膜內(nèi)Glut-1、VEGF陽性表達(dá)與正常組相比顯著增加(P＜0.01),在胰腺癌壞死組織周圍的癌細(xì)胞中表達(dá)更強(qiáng),結(jié)果見表2。

3 討論

本研究結(jié)果顯示胰腺癌組織Glut-1 mRNA、VEGF mRNA水平明顯高于正常組織(P<0.01),且Glut-1的表達(dá)與VEGF的表達(dá)呈正相關(guān)性。結(jié)果說明Glut-1作為VEGF的靶基因產(chǎn)物,由于胰腺癌對能量需求的增加刺激VEGF mRNA增多,使VEGF表達(dá)上調(diào),結(jié)果表現(xiàn)為胰腺癌血管生成,癌細(xì)胞能量供應(yīng)充足,癌細(xì)胞攝取葡萄糖加強(qiáng),刺激Glut-1 mRNA增多,最終導(dǎo)致Glut-1的表達(dá)增加。

本研究結(jié)果提示Glut-1、VEGF在胰腺癌的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用,為今后以Glut-1、VEGF為靶點的臨床基因治療和預(yù)防胰腺癌提供新的重要對策。

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