人脫細胞羊膜負載大鼠骨髓間充質干細胞構建組織工程膀胱的研究

王振顯 蔡文清 龐國勛 宋永周 陳康寧 孫福振 楊 濤(河北省人民醫院泌尿外科,河北 石家莊 05005)

最早應用組織工程學原理進行組織工程膀胱構建的是Wake forest大學醫學院再生醫學研究所的 Atala等人,他們于1998年進行了同種異體狗再造膀胱的實驗研究〔1〕。目前組織工程學技術的研究主要集中在二個方面:①支架材料的研究與開發;②種子細胞的培養和植入受損的組織,使其功能得到恢復。膀胱無細胞基質和小腸黏膜下層是目前報道最多的組織工程膀胱支架材料。羊膜是一種天然高分子生物材料,來源廣泛,不違背倫理。本研究采用化學去污劑和酶消化的方法去除新鮮羊膜中的細胞成分,保留細胞外基質,制備人脫細胞羊膜(HAAM)作為支架材料,并以大鼠骨髓間充質干細胞 (MSCs)為種子細胞構建了組織工程膀胱,探討異種來源的 HAAM作為生物支架材料構建組織工程膀胱的可行性。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 4～6周齡 100～150 g健康清潔級 SD大鼠 2只,8周齡 220～250 g大鼠 4只,雌雄不限。8周齡以上成年健壯雄性 300～500 g大鼠 60只,由河北醫科大學實驗動物中心提供。L-DMEM及 0.25%胰蛋白酶 (Sigma公司),胎牛血清(北京元亨圣馬公司)、,PBS液,二甲基亞砜 (DMSO,美國 R&D公司),1%TritonX-100,小鼠抗大鼠α-平滑肌肌動蛋白一抗,山羊抗小鼠二抗。日本Olympus熒光倒置顯微鏡 IX71和光學顯微鏡 CX31。SHZ-88臺式水浴恒溫震蕩器 (江蘇太倉市實驗設備廠)。

1.2 種子細胞培養

1.2.1 SD大鼠MSCs的分離與原代培養〔2〕4～6周齡大鼠 2只,無菌取其雙側股骨、脛骨和胸骨,用 L-DMEM培養基沖出骨髓于離心管中,吹打制成單細胞懸液,離心后用生長培養基重懸。將細胞接種于培養瓶中,37℃、5%CO2環境下常規培養。

1.2.2 大鼠膀胱勻漿上清液對MSCs的誘導分化 8周齡大鼠 4只,無菌取其膀胱,立即用 PBS液沖洗,勻漿、離心,取上清液用 0.2μm的針頭濾器過濾。取第 4代 MSCs以 2×104/m l密度接種于預置蓋玻片的 6孔培養板中培養 2 d,使細胞貼壁。吸出培養基,換入含有 1%DMSO的培養基預誘導 8 h,然后換入膀胱勻漿上清液與 DMEM為 1∶1的混合培養基培養 7 d。期間換液 1次。

1.2.3 培養細胞免疫細胞化學染色鑒定及純度計算 誘導分化的MSCs以α-平滑肌肌動蛋白 (S M-α-actin)抗體行免疫細胞染色,以未進行誘導的MSCs為陰性對照,進行同樣的染色處理。光學顯微鏡下觀察,隨機選擇 10個鏡野,計算純度,純度 =染色細胞數 /細胞總數,取平均值。

1.3 HAAM制備

1.3.1 羊膜的選材 嚴格遵循供體醫學標準。在獲取健康胎盤后,PBS液反復沖洗,鈍性分離羊膜與絨毛膜組織,去除羊膜基底面殘存的絨毛膜和血管組織,浸泡于以 0.01 mol/L PBS液稀釋的 1%TritonX-100中,反復震蕩搖晃 24 h,然后置入 1%胰蛋白酶中再震蕩搖晃 4 h取出,PBS沖洗。制備好的單層羊膜為白色半透明的薄膜,有一定彈性及韌性,厚約 0.1 mm。由于其較薄,缺乏一定的張力,尚不能用于手術修補。將 6～8片處理好的單層羊膜按彼此纖維方向垂直的位置重疊,以 200 W的可見光照射 3 h,從而使其交聯成 0.6～0.8 mm的較厚補片,張力大大增加,能耐受縫合牽拉的力量。以鈷 60射線照射20 min消毒 (20 kGy)后備用。

1.3.2 HAAM細胞毒性測定 按照文獻〔3〕要求制備 HAAM浸提液;取誘導分化的 MSCs按 1×104細胞 /孔接種于 96孔板,正常培養基組為對照組,浸提液組為實驗組;MTT法測定吸光度 A值,計算細胞相對增殖率 (RGR),RGR=實驗組 A值 /對照組 A值,并對材料毒性評分〔4〕。

1.4 組織工程膀胱的構建

1.4.1 MSCs接種 誘導分化后的 MSCs以 2×104/m l密度接種于預置 2 cm×2 cm HAAM的 6孔培養板中后加培養基 2 m l。置 37℃、5%CO2培養箱內,在飽和濕度條件下復合培養。

1.4.2 MSCs/HAAM復合物顯微鏡檢查 收獲培養 36 h的MSCs/HAAM復合物,HE染色光鏡及掃描電鏡檢查。

1.5 大鼠膀胱修復重建實驗

1.5.1 大鼠膀胱重建 將 60只兔隨機分為 3組,每組 20只。麻醉后取下腹部正中切口,顯露膀胱,游離膀胱周圍組織,行半膀胱切除術,以嬰幼兒輸液器作為導尿管順行置入,尿道外口處 4號絲線妥善縫合固定尿管。A組以MSCs/HAAM復合物補片用 5-0可吸收線縫合于膀胱缺損處,B組以單純 HAAM補片修補膀胱,C組不使用任何材料直接縫合。經尿管注水檢查無漏尿。A、B兩組以 1-0絲線在吻合口前、后、左、右 (漿膜面,避免穿透)各縫 1針作為標記。C組吻合口上下端以 1-0絲線縫合 2針作為標記。尿管于術后 7 d拔出。所有動物術后均肌肉注射青霉素抗感染 3 d。

1.5.2 術后膀胱檢測 分別于術后 2、4、8 w時,每組取 5只動物處死。處死前測定膀胱最大容積 (Volmax)。方法是將膀胱排空,用注射器經細尿管 (嬰幼兒輸液器)向膀胱注入生理鹽水,尿道外口有尿液滴出時注入的水量即為 Vo lmax。解剖觀察膀胱大體形態,并根據標記線取材固定,HE染色后光鏡下觀察組織學變化。第 8周時各組動物進行膀胱造影后再進行前述處理。

2 結 果

2.1 種子細胞培養 原代培養的骨髓細胞成分復雜,形狀不規則。7～9 d細胞長滿瓶底,主要呈紡錘形細胞。誘導分化7 d后MSCs轉變為梭形平滑肌樣的細胞,融合后形成峰谷排列,部分細胞表現為 S M-α-actin染色陽性,胞漿呈現棕黃色。隨機計數 10個視野計算誘導分化率為 (45.6±3.5)%。未進行誘導的 MSCs亦有少量細胞 S M-α-actin染色陽性 (3.8±0.77)%。

2.2 HAAM檢測 將經物理和酶處理的 HAAM做 HE染色,置光學顯微鏡下觀察,可見大量淺紅色膠原纖維未受損,無藍染核物質,表面沒有殘留的細胞碎屑。掃描電鏡下 HAAM表面粗糙,一面為網狀纖維結構,孔隙較多,大小不一。兩面均無細胞殘留 (圖 1)。HAAM浸提液組細胞平均相對增殖率為 88%,毒性評分為Ⅰ級 (表 1),證明所制備的 HAAM組織相容性好,符合生物材料應用要求。

表 1 細胞相對增殖率和細胞毒性分級

表 1 細胞相對增殖率和細胞毒性分級

與對照組比較:1)P＜0.05

2 0.812±0.1671) 1.009±0.082 80 4 1.070±0.0251) 1.210±0.028 87 6 1.126±0.1061) 1.202±0.071 90 8 1.292±0.0651) 1.364±0.080 95

2.3 組織工程膀胱構建 復合培養 36 h后 HE染色觀察可見HAAM材料上生長的細胞,部分融入支架材料內;掃描電鏡下可見MSCs生長良好,且有突起伸出固定于周圍支架材料 (圖 1)。

2.4 大鼠重建膀胱的大體觀察及容量測定 A、B、C三組術后1 w內分別死亡 5只、4只和 1只,均死于尿外滲和膀胱周圍感染。另外 A、B兩組均有一只動物有明顯尿外滲 (腹腔腫大),但未死亡,后尿外滲逐漸好轉。術后 2 w時重建膀胱被大網膜包繞,仔細分離后可見標記線內膀胱已愈合良好,但較薄,不能辨認出 HAAM。4、8 w時仍可見局部黏連,A、B兩組膀胱已達正常膀胱外觀,C組膀胱明顯縮小,局部黏連比 A、B兩組輕微。2 w時 A組大鼠膀胱的 Volmax為 (1.21±0.60)ml,B組為(1.12±0.53)m l,兩組比較無統計學意義 (P＞0.05),C組(0.75±0.41)m l,與 A、B兩組比較均有顯著差別 (P＜0.05)。隨時間延長,4、8 w時大鼠的膀胱容量略有增加但兩組仍無差別。8 w時膀胱造影見A、B兩組重建的膀胱與正常膀胱相似,C組膀胱明顯縮小 (表 2、圖 2)。

2.5 重建膀胱的組織學觀察 A組和B組術后 2 w時 HAAM修復區已有上皮細胞和膀胱平滑肌細胞形成,但B組平滑肌和上皮層較薄,平滑肌不規則,A組則上皮層和平滑肌略厚,相對規則。兩組均有嗜酸細胞和淋巴細胞等炎性細胞浸潤 (圖 3);4和 8 w時兩組已經與正常膀胱組織無明顯區別。C組 2 w時切口區僅輕微炎性細胞浸潤,無其他異常。

圖 1 HAAM檢測及組織工程膀胱構建

圖 2 各組 8 w時膀胱造影

表 2 手術各組術后不同時間 Volmax的測定結果

表 2 手術各組術后不同時間 Volmax的測定結果

與 C組比較:1)P＜0.01

A組 (n=15) 1.21±0.601) 1.28±0.551) 1.31±0.721)B組 (n=16) 1.12±0.531) 1.20±0.641) 1.25±0.591)C組 (n=19) 0.75±0.41 0.91±0.48 0.93±046

圖 3 A組和 B組重建膀胱的組織學觀察(HE,×100)

3 討 論

組織工程學是近年來新興起的一門學科,受到了科學界的廣泛關注。其核心是利用組織工程學技術與生命科學的成果,將活細胞與生物材料結合,修復、重建、維持、恢復或提高人體組織的功能〔5〕。組織工程的理想支架材料應該具備如下條件:①有良好的組織相容性;②生物可降解性;③無免疫原性;④具有多孔性和高空隙率,利于細胞的貼附和生長,誘導組織再生;⑤可塑性;⑥有一定機械強度。而 HAAM作為一種天然細胞外基質生物材料,幾乎具備以上各種生物特性,最有可能在組織體內完全再生,并可負載細胞生長。Meller〔6〕將結膜細胞種植于羊膜上,BrdU標記后植入無胸腺鼠皮下,植入后 14 d可以追蹤到 84%的標記細胞,同時其他指標也顯示黏附于羊膜上的細胞具有干細胞特點,表明羊膜為干細胞提供了有利環境。本實驗應用去污劑洗滌和酶消化的方法獲得 HAAM,經過光鏡和電鏡檢查,完全去除了細胞碎屑,降低了細胞免疫原性,又不損害HAAM的膠原成分,采用MTT法進行了細胞相對增殖性測定,細胞相對增殖率 ＞80%,細胞毒性Ⅰ級,符合生物材料的應用要求,因此是理想的支架材料。

穩定可靠迅速地獲取充足的有活力的細胞源是組織工程的另一個重要問題。目前膀胱組織工程中常用的種子細胞為膀胱移行上皮細胞和膀胱平滑肌細胞,進行支架材料雙面種植〔7〕。但是上皮細胞和膀胱平滑肌細胞取材培養困難,且體外擴增傳代有限,雙面種植較為困難。MSCs是來源于中胚層的一類干細胞,主要存在于骨髓及其他結締組織,不僅具有向中胚層分化的能力,而且具有向內胚層和神經外胚層來源的組織細胞分化的能力,在特定條件下可定向分化為骨、肌肉、血管內皮和神經等多種終末功能的細胞,參與自身組織細胞的更新、再生、修復和分化〔2〕。楊景全等報道〔8〕,大鼠脊髓勻漿上清液可在體外有效地誘導骨髓MSCs分化為神經樣細胞。受此啟發,我們利用膀胱組織勻漿上清液和 DMSO對MSCs在體外進行誘導分化為平滑肌樣細胞,經α-平滑肌肌動蛋白抗體檢測,誘導分化率將近 50%,因此可作為種子細胞進行種植。各種資料及臨床經驗提示,移行上皮具有很強的再生及修復能力,因此本實驗未專門進行上皮細胞的種植。實際上,在體內微環境的影響下,部分MSCs亦有自主向上皮細胞轉化的可能。

MSCs與 HAAM在體外短暫培養 24～36 h即可完成體外組織工程膀胱的構建,掃描電鏡檢查可見細胞黏附固定在支架材料上。重建膀胱的組織學顯示,2 w時 HAAM移植物即已降解吸收,移行上皮和膀胱平滑肌開始形成。無論單獨使用 HAAM還是使用MSCs/HAAM復合物進行膀胱替代,均沒有發生移植排斥和壞死反應。比文獻報道的應用無細胞膀胱基質 (厚約0.3 cm)進行膀胱替代吸收要早,炎性反應要輕微。表明HAAM組織相容性好,降解吸收快速完全且排斥反應輕微。雖然 A、B兩組在膀胱容量上沒有顯著性差別,但組織學顯示應用MSCs/HAAM復合物修補的膀胱修補區肌肉組織再生比較完全,其膀胱動力學功能可能要優于單獨應用 HAAM進行修補的膀胱。這需要進一步的實驗來證實。無論如何,與單純縫合而不用任何生物材料的 C組相比,A、B兩組膀胱容量明顯較大,證實 HAAM移植比單純縫合膀胱更能維持其生理功能。

本實驗表明,負載了以MSCs作為種子細胞 HAAM是較理想的組織工程膀胱材料,具有良好的應用前景。

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2 Bianco P,RiminucciM,Gontho s S,et a l.Bone marrow stromal stem cells,nature,biology,and potential applications〔J〕.Stem Cells,2001;19:180-92.

3 中國標準出版社第一編輯室編 .醫療器械生物學評價標準匯編,醫療器械生物學評價第 12部分 .樣品制備與參照樣品〔M〕.北京:中國標準出版社,2004:80-8.

4 中國標準出版社第一編輯室編 .醫療器械生物學評價標準匯編,醫療器械生物學評價第 5部分 .體外細胞毒性實驗〔M〕.北京:中國標準出版社,2004:186-97.

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6 MellerD,DabulV,Tseng SC.Expansion of conjunctival ep ithelialp rogenitor cellson amniotic membrane〔J〕.Exp Eye Res,2002;74(4):537-45.

7 Brown AL,Brook-Allred TT,WaddellJE,et a l.Bladder acellularmatrix as a substrate for studying in vitro bladder smooth muscle-urothelial cell interactions〔J〕.Biomaterials,2005;26(5):529-43.

8 楊景全,路來今,閆 俊,等 .大鼠脊髓勻漿上清液對骨髓間充質干細胞的誘導分化作用〔J〕.中國老年學雜志,2007;27(2):245-6.