玉米赤霉烯酮降解的研究進展

熊凱華 程波財,2 胡 威 汪孟娟 葉若松 魏 華

(食品科學與技術國家重點實驗室1,南昌 330047)

(中南大學資源加工與生物工程學院2,長沙 410083)

玉米赤霉烯酮降解的研究進展

熊凱華1程波財1,2胡 威1汪孟娟1葉若松1魏 華1

(食品科學與技術國家重點實驗室1,南昌 330047)

(中南大學資源加工與生物工程學院2,長沙 410083)

真菌毒素廣泛存在于世界各地的谷物及其副產物當中。玉米赤霉烯酮 (Zearalenone)作為鐮刀霉毒素的代表,是影響食物安全的重要因素之一。傳統的毒素清除方法包物理和化學方法。物理方法能部分清除毒素,但易破壞食物的營養物質,化學方法隨著化學試劑的添加會引入不確定的危害因素。生物降解作為目前的研究熱點,可在溫和條件下微生物將毒素轉化為無毒產物。報道了物理、化學和生物方法清除玉米赤霉烯酮的研究進展,重點對生物降解進行了綜述。

玉米赤霉烯酮 真菌毒素 生物降解 清除

食品安全已成為世界各國普遍關注的焦點問題,它不僅涉及到貿易壁壘中的技術問題,而且涉及到從農場到餐桌的食物鏈安全保障問題。為此,我國科技部先后啟動“十五”和“十一五”科技支撐計劃,設立“食品安全關鍵技術”重大專項,針對一些迫切需要控制的食源性危害 (化學性、生物性)進行系統攻關。生物毒素是食源中較為廣泛的危害之一,真菌毒素作為影響食品安全的一大類生物毒素,成為科技攻關的核心問題。

玉米赤霉烯酮 (Zearalenone,ZEN)是世界上污染范圍最廣泛的一種鐮刀霉毒素,在歐洲、非洲、亞洲、北美洲、南美洲以及大洋洲等世界各地的谷物以及農副產品中都檢測到 ZEN的存在[1]。ZEN可在玉米中以 11.8 mg/kg的極高濃度出現[2],在燕麥、小麥、大麥和高粱中也被廣泛檢出。ZEN一般通過污染的作物進入食物鏈,奶制品、牛肉和羊等制品中的 ZEN最大質量濃度達 21 mg/kg[3],某些食物中 ZEN污染量甚至高達 289 mg/kg[4]。長期以來有關 ZEN污染的報道很多,ZEN危害機體健康的科學實驗也有一些詳實的報道。盡管 ZEN等真菌毒素會通過食物鏈在人體或動物體中造成蓄積,但可以借助于一些物理、化學和生物學手段破壞或降低其毒性,而利用生物手段進行真菌毒素的降解則是近年來科技界研究的熱點和焦點。目前有關 ZEN生物降解的研究很少,也沒有這方面的綜述報道,本文將近十年來科學界對 ZEN的清除、轉化及生物降解性研究進展進行了綜述。

1 玉米赤霉烯酮化學結構及性質

1.1 化學結構

玉米赤霉烯酮是由禾谷鐮刀菌 (Fusarium gra2 minearum)、黃色鐮刀菌 (Fusarium culmorum)、克地鐮刀菌 (Fusarium crookwellense)等多種鐮刀霉菌產生并釋放到土壤環境中的真菌毒素[5]。

1962年 Stob從感染了禾谷鐮刀菌的發霉玉米中成功分離到具有雌性激素作用的玉米赤霉烯酮。1966年 Urry用經典化學、核磁共振和質譜技術確定了玉米赤霉烯酮的化學結構并正式確定其化學名稱為:6-(10-羥基 -6-氧代 -反式 -1-十 -碳烯)-β-雷鎖酸 -內酯。自然界中還存在 ZEN的多種衍生物,最常見的兩種衍生物為α-玉米赤霉烯酮(α-zearalenol)和 β -玉 米 赤 霉 烯 酮 (β -zearalenone),其衍生結構如圖 1[1]:

圖 1 ZEN及其兩種衍生物的化學結構

1.2 化學性質

ZEN又名 F-2雌性發情毒素,其形成過程與自然界脊椎動物荷爾蒙 (如雌二醇)相似。由于動物都有該類激素受體 (對雌激素化合物有高親和性),因而最容易受這種真菌毒素的影響[4]。

進入人和動物體內的 ZEN在機體內產生雌激素效應綜合癥狀,包括影響雌性哺乳動物乳房發育、抑制多倍排卵,導致哺乳推遲、外陰陰道炎、連續動情期、假孕、不育等[6]。甚至會導致不孕或流產,胎兒染色體出現異常、畸形和死胎。新生雌性大鼠單次皮下注射實驗和小豬喂食實驗已經證實了以上生殖毒性和致畸作用[6-7]。除此之外,ZEN還能導致雄性動物睪丸萎縮,精液質量低劣[6]。α-zearalenol的雌激素活性是 ZEN的 10～20倍,而β-zearalenol的雌激素活性則比 ZEN要低許多[4]。

ZEN還具有致癌性,它會顯著增加細胞色素CYP1A1酶活性及其 mRNA表達,刺激人類乳腺癌MCF-7細胞的生長,而細胞色素 CYP1A1酶已被證明是乳腺癌形成的病因[8]。同時 ZEN也是人類食道癌發病率增加的病因之一[6]。研究還發現,當機體內 ZEN濃度過高時,小鼠肝細胞的腺瘤和垂體的腫瘤發生機會會明顯增加[9]。另外,ZEN對動物體腎臟、肝臟均能產生毒害作用[10]。

鑒于 ZEN污染的廣泛性和毒性,世界糧農組織和世界衛生組織制定了 ZEN的每日最大耐受攝入量(Provisional Maximum Tolerable Daily Intake)為0.5μg/kg·bw·d[9]。許多國家也制定了食品中ZEN的限量標準,中國《糧食衛生標準》(GB2715—2005)規定小麥和玉米中的 ZEN不得超過 60μg/kg。

2 ZEN清除方法

ZEN通過飼料、食品加工原料形式進入食物鏈。為避免 ZEN對人體健康帶來危害,一方面需要建立和健全污染監督、監控的機制,另一方面需要研究高效清除的方法。目前清除 ZEN的方法可分為:物理方法、化學方法和生物方法。

2.1 物理方法

物理方法主要包括熱處理和吸附劑吸附。熱處理是應用較早的一種方法,通常認為溫度越高對毒素清除效果越好。120～140℃加壓烹飪可除去被污染食物中 73%～83%的 ZEN[11]。水或其他化合物的存在會降低 ZEN的熱穩定性,因此大麥粉中 ZEN的分解速度大于 ZEN純品[12]。

吸附是利用活性炭、皂土等吸附劑的疏水作用來達到不同程度地清除食物中真菌毒素的目的?；钚蕴渴怯行У?ZEN吸附劑之一 (每克活性炭能吸附354.2μmol ZEN)[13]。為增強吸附效果,試驗嘗試著通過適當修飾 (在黏土的表面加上十六烷基三甲基銨)來提高黏土等鋁矽酸鹽表面的疏水性,從而提高吸附 ZEN的能力[14]或通過加入陽離子表面活化劑十六烷基吡啶鎓和 N,N-二甲基 -N-十八碳酰基芐銨來增加蒙脫石表面吸附 ZEN能力[15]。

2.2 化學方法

1997年 McKenzie等[16]發現,乙腈水溶液中的臭氧在 15 s內可完全清除濃度為 20μg/mL的 ZEN,反應后用 HPLC檢測不到 ZEN的存在,并且經紫外、熒光檢測,未發現有新產物出現[16]。

傳統的物理和化學方法雖然能部分清除真菌毒素,但有著不可避免的缺點:熱處理需要的高溫破壞了食品或飼料的營養價值,且 ZEN熱分解產物的毒性依然未知。黏土和活性炭等是非專一性吸附劑,在吸附 ZEN毒素的同時,也吸附大量食物中的微量營養物質;被吸附劑吸附的毒素,在無法被分解的情況下會造成再次污染;化學試劑的添加會引入不確定的危害因素。

2.3 生物方法

為尋求一種安全、有效的真菌毒素清除方法,20世紀 60年代,開始嘗試用生物學資源進行真菌毒素的降解。采用微生物清除食物鏈中真菌毒素的方法已被科學界所關注,清除過程包括微生物菌體吸附毒素和微生物將毒素代謝為無毒產物。尤其是后者,這種“解毒”性質的降解正是目前生物方法研究的重點。

2.3.1 微生物菌體吸附

釀酒酵母在體外能夠清除大量真菌毒素[17]。Bakutis等[18]隨后發現酵母細胞壁對毒素具有很好的清除作用,采用的釀酒酵母 (Saccharomyces cerevi2 sae)、深紅類酵母 (Rhodotorula rubra)、膠紅類酵母菌(Rhodotorula glutinis)、發酵地霉酵母 (Geotrichum fer mentans)和馬克思克魯維酵母 (Kluyveromyces ma2 rxianus)都可以使 ZEN的含量顯著降低。Niderkorn等[19]模擬自然條件下青貯飼料中的 pH值和菌體密度,發現酵母菌以外的鏈球菌屬 (Streptococci)、腸球菌屬 (Enterococci)也能較好地清除 ZEN,德氏乳桿菌(Lactobacillus delbrueckii ssp.bulgaricus R0149)甚至能除去 88%的 ZEN。由于沒有檢測到降解產物的出現,推測該清除過程可能與細胞壁的吸附有關,胞壁上的β-D-葡聚糖等多糖是細胞壁吸附的主體,疏水作用在其中起著重要作用。熱處理或酸處理時,細胞壁多聚糖和肽聚糖的糖苷鍵或者肽鍵斷裂,使肽聚糖結構變薄而孔徑增大,菌體對真菌毒素的吸附能力增加[20-21]。為進一步驗證這種吸附作用,El-Nezami等[4]用甲醇來抽提已吸附真菌毒素的菌體細胞,發現甲醇回收了近 50%的 ZEN。

2.3.2 微生物降解

目前,關于生物降解 ZEN毒素的研究比較少,根據其產物類型分為轉化或降解,具體歸納為以下幾種:

①轉化為α-zearalenol。少數乳桿菌 (Lactoba2 cilli)、明串珠菌 (Leuconostoc)可以將 ZEN轉化為α-zearalenol,但動物實驗證明α-zearalenol的雌激素毒性可達到 ZEN的 10～20倍[4],因此這種方式的轉化并不能看作為去毒性的降解[19]。

②轉化為α-zearalenol和β-zearalenol。葡枝根霉(Rhizopus stolonifer)等根霉屬菌株和部分絲狀真菌及酵母在一定條件下可將 ZEN轉化成αzearalenol和β-zearalenol,研究人員同樣認為這種轉化不能作為解毒作用[22]。但由于β-zearalenol的雌激素活性比 ZEN要低許多[4],Utermark因此認為β-zearalenol衍生物的出現可以看作是一種解毒作用[23]。

③轉化為硫酸鹽。少根根霉 (Rhizopus arrhizus)可將 ZEN毒素 C-4位的羥基氧化為硫酸根,從而將ZEN轉化為硫酸鹽,有關該硫酸鹽產物的毒性大小目前還沒驗證[24]。

圖 2 ZEN硫酸鹽結構圖

④降解成二氧化碳或無熒光、無紫外吸收的物質。毛孢子菌屬嗜霉菌毒素菌株(Trichosporon myco2 toxinivorans)可在 24 h內將 ZEN降解成二氧化碳或者無熒光和無紫外吸收的代謝物,代謝物中沒有檢測到α-zearalenol、β-zeatalenol或 ZEN的存在。細胞培養試驗顯示,該產物對 MCF細胞無雌激素毒性[25],Schatzmayr和Molnar在隨后的試驗中也分離得到了類似的降解菌株[17-18]。

⑤降解成 1-(3,5-二羥苯基)-10’-羥基 -1’反式 -十一碳烯 -6’-酮。Hideaki分離到粉紅螺旋聚孢霉 (Clonostachys rosea IFO7063)菌株,可將ZEN轉化為 1-(3,5-二羥苯基)-10’-羥基 -1’反式 -十一碳烯 -6’-酮。該降解產物無任何雌激素活性[6]。由單拷貝基因 zhd101所編碼的堿性乳糖水解酶則是粉紅螺旋聚孢霉降解 ZEN的功能性蛋白[26],插入失活試驗也證明了這一點[23]。

近年,zhd101基因的克隆及相關轉基因研究取得了一定進展。zhd101基因被成功克隆到大腸桿菌(Escherichia coli)和釀酒酵母 (Saccharomyces cerevi2 sae)中,導入了該片段基因的大腸桿菌在 24 h內可將培養基中所有的 ZEN、α -zearalenol和 β -zearalenol降解成無毒產物[27]。此外,zhd101基因還被導入到玉米中,形成轉基因玉米。該轉基因玉米在 48 h內可降解溶液中 90%的 ZEN,每克轉基因種子可以清除 16.9μg ZEN[28]。

3 展望

隨著微生物工程和基因工程技術的飛快發展,越來越多的真菌毒素降解菌株和降解酶會被人們發現,各種潛藏的毒素降解機制也將逐漸為人類所了解和掌握。ZEN水解酶編碼基因的獲得為真菌毒素的控制提供新的方向,轉基因玉米株的構建為未來將真菌毒素阻斷在作物收獲之前提供全新的思路,而現有的物理化學清除毒素方法將成為歷史,多種真菌毒素混合的抗性菌株可能會成為將來科研攻關的方向和重點。

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Research Progress on Zearalenone Degradation

Xiong Kaihua1Cheng Bocai1,2HuWei1WangMengjuan1Ye Ruosong1Wei Hua1
(The State Key Laboratory of Food Science and Technology,Nanchang University1,Nanchang 330047)
(School of Resources Processing and Bioengineering of Central South University2,Changsha 410083)

Zearalenone is the most widely polluting mycotoxin produced by Fusarium for crop.Research pro2 gress of physical,chemical and biologicalmethods in removing zearalenone is reviewed in this paper.The biodegra2 dation methodspresentpotential utilization in the future with their superiority in overcoming the disadvantages such as incomplete degradation of toxin and loss of nutrients due to the physical and chemical treatments.

zearalenone,mycotoxin,biodegradation,remove

Q-1

A

1003-0174(2010)01-0138-05

國家自然科學基金(3086008)

2009-02-26

熊凱華,男,1986年出生,碩士,微生物工程

魏華,男,1966年出生,研究員,博士生導師,食品生物技術