人骨形態(tài)發(fā)生蛋白2基因治療大鼠牙槽骨缺損的實(shí)驗(yàn)研究*

西安交通大學(xué)口腔醫(yī)院(西安710004)

王 敏 程 政 姚天華 代 泉 郭秀全

骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(BMP-2)是啟動(dòng)骨修復(fù)過程的關(guān)鍵因子。大量的研究已證實(shí)hBM P2在體內(nèi)能誘導(dǎo)骨的形成,在體外對(duì)骨髓基質(zhì)細(xì)胞(MSCs)有強(qiáng)烈的骨誘導(dǎo)活性,而且能夠使誘導(dǎo)性骨細(xì)胞向確定性骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化[1]。我們擬通過以重組腺相關(guān)病毒為載體,介導(dǎo)h BMP-2治療大鼠的實(shí)驗(yàn)性牙槽骨骨缺損。

材料和方法

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和主要試劑 采用雌性成年SD大鼠30只,體重280～300g(西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心提供);高效表達(dá)人骨形態(tài)發(fā)生蛋白2腺病毒載體構(gòu)建及目的蛋白的檢測(cè)按作者早先的方法[2];Rabbit antiprotein試劑盒(北京博奧森生物技術(shù)有限公司提供)。

2 動(dòng)物模型的建立及分組 所有的動(dòng)物采用10%水合氯醛腹腔注射,麻醉劑量為0.4ml/100g。于下頜11牙間牙槽嵴處切開,分離牙齦及骨膜,暴露牙槽骨。用5號(hào)裂鉆(3×105r/min)制作出貫通唇舌側(cè)約2.0mm×2.0mm大小的人工骨缺損區(qū)。用0.9%生理鹽水反復(fù)沖洗創(chuàng)傷面嚴(yán)密止血后,隨即分成2組。實(shí)驗(yàn)組植入浸有 r AAV-hBMP2-GFP病毒液50u1(感染滴度3.6×1011/ml)的明膠海綿塊;對(duì)照組植入浸有AAVGFP空病毒溶液50μl(感染滴度 3.6×1011/ml)的明膠海綿塊。所有動(dòng)物嚴(yán)密關(guān)閉傷口,術(shù)后前3d飲用水中加青霉素80萬(wàn)單位。術(shù)后除對(duì)照組2只動(dòng)物意外死亡外,其余動(dòng)物傷口均愈合良好。術(shù)后15d、30d、60d實(shí)驗(yàn)組分別處死動(dòng)物5只,對(duì)照組分別處死動(dòng)物4只,獲取包括骨缺損及下頜11在內(nèi)的骨組織塊樣品備用。

3 觀察項(xiàng)目(1)X線檢查:術(shù)后攝下頜11正位X片,應(yīng)用計(jì)算機(jī)圖像分析軟件測(cè)定骨缺損區(qū)平均密度值(密度值范圍0～1)。(2)組織學(xué)觀察:各組一半樣品用OCT包埋,-27℃切片(每個(gè)樣品取2張切片),厚度16μm,載玻片上晾干,4%多聚甲醛固定 20min(室溫),-20℃保存。從-20℃取出晾干,室溫下浸0.3%TritonX-100溶液40min,水洗,PBS洗2～3次,羊血清封閉1h(37℃),浸于Rabbit anti BMP2(1∶100)溶液,4℃過夜(18h左右),PBS洗1h(換液3次以上),羊抗兔二抗-FITC(1∶50稀釋),37℃2h,PBS洗1h(換液3次以上),甘油PBS封片,熒光顯微鏡觀察,照相。各組一半樣品10%甲醛液固定,PL脫礦,石蠟包埋,切片(每個(gè)樣品2張切片),HE染色,普通光鏡觀察,照相。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPPS13.0統(tǒng)計(jì)軟件包對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示(±s),兩組間比較采用t檢驗(yàn)。

結(jié) 果

1 各組骨密度值檢測(cè)結(jié)果見附表。兩組樣本牙槽骨缺損處的骨密度值隨時(shí)間的增加而增高;在 15d、30d、60d,實(shí)驗(yàn)組樣本牙槽骨缺損處骨密度值(0.062,0.236,0.456)均高于對(duì)照組(0.054,0.158,0.216),其中 30d、60d兩組有顯著性差異(P＜0.05,P＜0.01)。

附表 術(shù)后骨密度值檢測(cè)結(jié)果(±s)

附表 術(shù)后骨密度值檢測(cè)結(jié)果(±s)

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2 組織學(xué)觀察 ①免疫組化染色冰凍切片觀察:兩組樣品術(shù)后 15d均可見綠色熒光蛋白(圖1,圖2);實(shí)驗(yàn)組30d和60d樣品骨缺損區(qū)周邊組織中綠色熒光強(qiáng)度較對(duì)照組明顯加強(qiáng)(圖3、圖4)。②HE染色切片觀察:實(shí)驗(yàn)組:術(shù)后 15d,牙槽骨缺損區(qū)周圍組織成纖維細(xì)胞和毛細(xì)血管生長(zhǎng)活躍,周邊有骨樣組織和少量的新生骨形成(圖5);術(shù)后 30d,新骨形成增多向中心聚集;術(shù)后60d,缺損區(qū)幾乎被新生骨組織充填,新生骨鈣化加強(qiáng)(圖6)。對(duì)照組:術(shù)后 15d,骨缺損區(qū)周邊成纖維細(xì)胞和毛細(xì)血管生長(zhǎng)活躍,術(shù)后30d,骨缺損區(qū)纖維組織彌散,周邊可見成骨細(xì)胞和少量骨樣組織;術(shù)后 60d,骨缺損區(qū)邊緣有少量新骨沉積,腔內(nèi)被纖維組織充滿。

圖1 實(shí)驗(yàn)組術(shù)后 15d GFP表達(dá)(30×)

圖2 對(duì)照組術(shù)后 15d GFP表達(dá)(30×)

圖3 實(shí)驗(yàn)組術(shù)后 30d GFP表達(dá)(30×)

圖4 實(shí)驗(yàn)組術(shù)后 60d GFP表達(dá)(30×)

圖5 實(shí)驗(yàn)組缺損區(qū)新生骨組織(HE×40)

圖6 實(shí)驗(yàn)組新生骨組織鈣化加強(qiáng)(HE×40)

討 論

雖然BMP-2在體內(nèi)外均可誘導(dǎo)骨的形成,但由于生長(zhǎng)因子價(jià)格昂貴、用量大、半衰期較短、易擴(kuò)散、易降解等原因均限制了其應(yīng)用。目前,基因治療是骨缺損修復(fù)研究的熱點(diǎn)之一,已有學(xué)者應(yīng)用BMP-2進(jìn)行局部基因治療[3,4]。局部基因轉(zhuǎn)導(dǎo) BMP-2可以使基因產(chǎn)物向局部和靶向持續(xù)或緩慢的釋放,減小全身副作用,同時(shí)內(nèi)源性合成的蛋白質(zhì)可能比外源重組的蛋白質(zhì)具有更大的生物學(xué)活性[5]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:兩組樣品15天冰凍切片染色后均發(fā)現(xiàn)牙槽骨缺損區(qū)周邊組織有綠色熒光,表明 GFP基因已成功轉(zhuǎn)染至牙槽骨缺損區(qū)周邊的組織細(xì)胞,同時(shí)也表明目的基因 hBMP2也成功轉(zhuǎn)染;實(shí)驗(yàn)組30天和60天綠色熒光強(qiáng)度明顯比對(duì)照組增強(qiáng),說明被轉(zhuǎn)染h BMP2的組織細(xì)胞持續(xù)分泌hBMP2;實(shí)驗(yàn)組牙槽骨缺損處術(shù)后15天時(shí)就有骨樣組織出現(xiàn),術(shù)后30天有新生骨形成,60天缺損區(qū)幾乎被新骨充滿,新骨形成時(shí)間明顯早于對(duì)照組,且成骨量也明顯多于對(duì)照組,說明基因hBM P2已發(fā)揮成骨作用。推測(cè)其新骨發(fā)生機(jī)制:攜帶hBMP2目的基因的重組腺相關(guān)病毒液進(jìn)入牙槽骨缺損區(qū)后,hBM P2基因迅速被轉(zhuǎn)染給骨缺損區(qū)周邊組織細(xì)胞,并成功表達(dá) h BMP2。當(dāng)局部h BMP2濃度達(dá)到一定程度后,牙槽骨缺損區(qū)周邊結(jié)締組織中未分化的、有活力的間充質(zhì)細(xì)胞、骨膜基質(zhì)細(xì)胞、骨膜細(xì)胞[6],還有牙周膜細(xì)胞開始向成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化,成骨細(xì)胞再不斷增殖并形成膠原蛋白,促進(jìn)新骨基質(zhì)形成及新骨沉積。因此我們認(rèn)為,本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用重組腺相關(guān)病毒載體介導(dǎo)h BMP2基因治療牙槽骨缺損是成功的。

在基因治療中,載體的選擇最為關(guān)鍵。本試驗(yàn)以重組腺相關(guān)病毒為載體介導(dǎo) hBMP2基因直接植入大鼠體內(nèi),使hBMP2基因直接插入宿主細(xì)胞。這種方法操作簡(jiǎn)單,創(chuàng)傷小,費(fèi)用低,但對(duì)載體的安全性、轉(zhuǎn)染的靶向性和效率要求很高。近幾年,重組腺病毒相關(guān)病毒載體以其明顯的優(yōu)勢(shì)[7]倍受矚目:(1)對(duì)宿主沒有致病性;(2)能穩(wěn)定轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞,具有較長(zhǎng)時(shí)期的基因表達(dá)能力;(3)極低的免疫原性;(4)有廣泛的宿主群,可轉(zhuǎn)染分化及未分化細(xì)胞。重組腺相關(guān)病毒的這些優(yōu)勢(shì)使其成為基因治療載體研究的熱點(diǎn)并很有希望用于臨床基因治療。重組腺病毒相關(guān)病毒介導(dǎo)人骨形態(tài)發(fā)生蛋白2目的基因治療大鼠牙槽骨缺損的成功,為臨床基因治療牙周病骨缺損提供了實(shí)驗(yàn)和理論依據(jù)。今后我們將在諸如修復(fù)作用是否有劑量依賴性及與病毒滴度的關(guān)系等方面進(jìn)行更深一步實(shí)驗(yàn)研究。

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