神經生長因子對瘢痕成纖維細胞影響的實驗研究*

昆明醫學院第一附屬醫院整形外科(昆明 650032)

袁瑞紅 劉 流△ 趙德萍▲ 徐宏慧 孫家平 王福科 劉 垠

病理性瘢痕在臨床上發病率有上升的趨勢,隨著人們生活質量的提高,越來越受到人們的重視。目前比較一致的看法是瘢痕疙瘩是一個復雜的病變,與許多基因相關[1,2]。表皮角質形成細胞之間的相互作用和真皮成纖維細胞在調節和穩態瘢痕形成中發揮重要作用,瘢痕疙瘩和增生性瘢痕是相同的過程中的兩個不同階段[3,4]。近年的大量研究已表明,創傷部位細胞的多樣性和合成活性由各種生長因子調節,即生長因子參與了創傷修復的調控過程。生長因子大量釋放,迅速擴散,并被蛋白酶降解,新的生長因子又從趨化而來的細胞中合成,另外,細胞間基質也影響生長因子的作用,影響其溶解性及儲存。因此,在創傷修復的一系列過程中,生長因子起著關鍵性的作用。神經生長因子(Nerve growth factor,NGF)可由多種細胞分泌合成,如炎性細胞、修復細胞等,其生物學作用具有多樣性,均與創傷修復過程有密切關系,但其作用機制尚不明了。我們通過動物實驗研究了NGF對瘢痕成纖維細胞的影響,現報道如下。

材料和方法

1 實驗動物 成年健康 Sprague-Dawley(SD)大鼠 4只,雌雄各半,體重300±10g。

2 方 法 ①動物分組:將4只SD大鼠隨機分為NGF組(n=2)及空白對照組(n=2),每組又隨機分為7d、10d兩個時間組(n=1)。②動物模型:用 3%戊巴比妥鈉以 0.1ml/100g體重行腹腔注射麻醉,將鼠背剪毛,無菌條件下在鼠背部沿脊柱兩側各作三個直徑 1.5cm的圓形全厚皮膚缺損,建立大鼠全厚皮膚缺損模型。實驗側沿創面基底注射NGF(0.33μg/ml),對照側注射無菌生理鹽水,劑量均為0.5ml,每天注射1次,設空白對照,不用任何藥物。分別于手術后7d、10d處死各組動物,取材。③標本病理染色:中性甲醛液固定組織,酒精梯度脫水,透明,石蠟包埋,石蠟切片,厚度 3～5μm。行 HE染色、Cason氏改良三色染色(此法系Mallory氏染色法的改良,染色效果與Mallory氏染色法基本一致)、Hamason-Lushbangh氏染色(此法特點是利用銀溶液和其它多種染料將網狀纖維、膠原纖維和彈力纖維分別顯示出來,故又稱為三種纖維的聯合染色,染色效果較好)。④標本電鏡觀察:LKB-Ⅴ型切片機切片后檸檬酸鉛-醋酸鈾雙染色,JEM-100CX透射電鏡觀察、攝片、記錄。

結 果

1 動物模型標本病理染色觀察 對照組:7d組,膠原纖維排列疏松,平行排列,其間見少許成纖維細胞和少許微血管,皮膚附屬器消失。10d組更明顯(圖1,3)。NGF組:7d組,膠原纖維排列紊亂,沉積較少,其間見大量成纖維細胞和部分新生微血管,真皮內可見大量炎性細胞浸潤;10d組膠原纖維沉積增加,炎性細胞浸潤減少,其它改變不明顯(圖2,4)。

圖1 對照組 7d:膠原纖維平行于表皮排列,微血管數量減少,表皮增厚(LM×40)

圖2 NGF組7d:表皮層增厚,膠原纖維排列紊亂,真皮 內有大量炎性細胞浸潤,微血管數量增多(LM×40)

圖3 對照組 10d:大量膠原纖維沉積,排列紊亂,上皮釘突消失,上皮層增厚(LM×40)

圖4 NGF組 10d:膠原纖維增多,排列紊亂,炎性細胞浸潤少見,微血管豐富(LM×200)

2 動物模型標本超微結構觀察 空白對照組:7d組表皮未見明顯異常,皮下結締組織,膠原纖維排列致密,其間見較多毛細血管,膠原纖維間見少許成纖維細胞,且胞質欠豐富,部分成纖維細胞粗面內質網輕度擴張;10d組可見膠原纖維間較多梭形纖維細胞,胞質少,胞質內見少許粗面內質網及線粒體,部分線粒體腫脹嵴溶解。NGF組:7d組,上皮下見大量成纖維細胞,細胞胞質豐富,胞質內見大量粗面內質網,部分粗面內質網擴張,膠原纖維排列較疏松;10d組,膠原纖維排列較疏松,其間見較多成纖維細胞,成纖維細胞胞質豐富,胞質內見大量粗面內質網,部分內質網擴張明顯,局部見部分纖維細胞,纖維細胞呈梭形,胞質內見少許粗面內質網,局部見炎性細胞。

討 論

機體軟組織受創后,首先發生的是局部炎癥反應,在這一過程中中性白細胞浸潤,單核細胞參與組織碎片移出,繼而出現肌纖維母細胞、纖維母細胞、血管母細胞以及膠原等成分的增生,局部血運增加等病理生理反應,在這一系列變化中,NGF可以起一定的調節和促進作用,如果將 NGF注入到鼠背部的皮下創面,可以觀察到不同種類的炎癥細胞在組織受損部位的聚合顯著增加,首先是多形核白細胞,其次為單核細胞,再其次為成纖維細胞。NGF趨化和促進創面炎癥反應的特點和每一種細胞聚集峰值的大小與注入NGF的濃度呈正比。實驗表明,增生性瘢痕中存在NGF的異常高水平表達,且 NGF創面上皮化后仍可趨化、活化炎性細胞,并促進其增殖及脫顆粒。因此推測,增生性瘢痕內異常高水平的NGF能通過趨化、活化炎性細胞而啟動病理性膠原代謝。

有實驗表明,羊膜基底有大量的神經生長因子、轉化生長因子-β1和神經生長因子受體的表達。此外,除了神經生長因子的存在,可以大大增加TGF-β1的產生和釋放[5]。現在有學者提出“神經源性炎癥假說”,即過度的神經生長因子可誘導感覺纖維過度釋放神經肽,從而導致神經肽的積累,即使在沒有機械應力的作用下,仍然能導致瘢痕疙瘩和增生性瘢痕的形成[6]。神經生長因子在治療不同原因造成的潰瘍(角膜潰瘍、褥瘡、病毒感染、化學燒傷)時,可能縮短恢復進程,是因神經生長因子和(或)神經營養因子不同時間過程的受體(NGRF)/大鼠 p75(非編碼區)的表達,可能調節最后進程。因此,神經生長因子的潛在親愈合能力可能調節愈合過程中的一些病理變化[7]。局部應用神經生長因子可改善韌帶愈合促進再生和血管生成,并導致瘢痕增強韌帶的力學性能[8]。在心梗瘢痕愈合的研究中顯示,受損的疤痕在的地塞米松治療愈合后,衰減的瘢痕肌成纖維細胞增殖及神經生長因子的表達,有助于減少梗塞區域的神經反應[9]。有學者應用基因芯片技術研究顯示,在瘢痕疙瘩與正常皮膚中,有高表達的轉化生長因子-β(1)和神經生長因子[10]。

大鼠標本病理形態學觀察結果示,7d時,瘢痕組織內大量炎性細胞浸潤,膠原纖維排列紊亂,其間血管豐富,10d時,炎性細胞浸潤減少,膠原纖維形成較多,排列紊亂。標本電鏡觀察結果顯示,兩個時間段瘢痕組織內見大量成纖維細胞,細胞胞質豐富,見大量粗面內質網,部分粗面內質網擴張明顯。以上結果顯示,在創傷修復過程中,NGF促進了炎癥細胞的聚集,同時還促進了成纖維細胞的增殖,從而促進創傷的愈合,但過量應用也將導致病理性瘢痕的形成。

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