氧自由基增強脂肪細胞IL-6表達的實驗研究

第四軍醫大學西京醫院病理科(西安 710033)

王映梅 曲 萍* 鐵 茹* 張學策* 于軍* 陳寶瑩△

白細胞介素-6(Interleukin-6,IL-6)是一種促炎癥因子,參與到多種疾病如心血管病、肥胖、2型糖尿病等的發生、發展過程[1]。IL-6由多種細胞產生,包括活化的白細胞、內皮細胞及脂肪細胞。人類脂肪組織分泌大量 IL-6,這些 IL-6占循環中 IL-6總量的10%～35%,是肥胖引起的血中IL-6升高的主要來源[2]。肥胖人群循環系統中氧化應激標志物的量增多,而且增加的氧化應激主要是由于脂肪組織中氧自由基(Reactive oxygen species,ROS)產生的增多。ROS可以導致組織及體外培養的脂肪細胞中 PAI-1、TNF-α和IL-6等脂肪分泌因子的表達升高[3],但具體的調節機制并不清楚。因此,本實驗利用體外誘導、分化的脂肪細胞,觀察 ROS對 IL-6表達的調節,并進一步探討可能參與其中的信號轉導通路,為相關疾病的干預治療提供依據。

材料與方法

1 材 料 PD98059,SB203580及SP600125均購自 Sigma(Saint Louis,MO,USA);AG490及Akt抑制物(Akt inhibitor)購自 Calbiochem(San Diego,CA,USA);過氧化氫(H2O2)(Sigma,St.Louis,MO,USA);Trizol Reagent及ImProm-II反轉錄試劑盒(Promega,Madison,WI,USA)。多重免疫分析系統(Bioplex-Plex 100 suspension array system,Bio-Rad,Hercules,CA,USA)。

2 方 法(1)細胞培養及分化:3T3-L1細胞培養、誘導分化方法,及其活性檢測在我們以往的報道中有詳細描述[4]。(2)重組病毒感染 3T3-L1脂肪細胞:表達無活性 Akt的重組病毒(dominant-negative Akt,DN-Akt)由 Prof.K.S.Lam提供(香港大學內科系)。完全分化的3T3-L1脂肪細胞接種于6孔板,培養24 h后,加入用含 2%胎牛血清的DMEM稀釋的重組病毒(200 pfu/cell),培養 3h,再加入同體積的含10%胎牛血清的DMEM,繼續培養 24 h之后,去除培養液,PBS沖洗細胞,加入含10%胎牛血清的DMEM培養。該實驗以表達熒光素酶(luciferase,Luc)的病毒載體作為對照。(3)定量 PCR檢測基因表達水平:利用 Trizol提取3T3-L1細胞內總 RNA,使用 Im Prom-II反轉錄試劑盒將1μg RNA反轉錄成cDNA。以此 cDNA為模板,18s核糖體RNA作為內參照檢測目的基因的表達水平。定量 PCR體系采用 2×TaqMan Master Mix及20×TaqMan引物和探針(Applied Biosystems)。檢測系統采用 Applied Biosystems Prism 7000序列檢測系統,并利用 ABI Prism 7000 SDS軟件進行分析。(4)多重免疫分析及夾心 ELISA法檢測蛋白表達水平:多重免疫分析采用 Bio-plex 100懸浮分析系統(Bio-plex 100 suspension array system)及XY平臺(XY Platform,Bio-Rad,Hercules,CA,USA)。在不同時間點收集3T3-L1脂肪細胞的條件培養液,用小鼠脂肪分泌因子檢測試劑盒(St.Charles,MI,USA)檢測培養液內PAI-1的蛋白水平,同時 PAI-1的量也采用 ELISA的方法檢測。

3 統計學處理 所有實驗均至少獨立重復3遍。數據以均數±標準差(±s)表示,兩組間比較采用 t檢驗,多組間比較采用方差分析。P值小于0.05被認為具有統計學差異。

結 果

1 H2O2升高 3T3-L 1脂肪細胞 IL-6的表達 為了觀察氧化應激對脂肪細胞表達 IL-6的影響,本實驗采用不同濃度的H2O2(0.2mmol/L,0.5mmol/L,1mmol/L),作用于3T3-L1脂肪細胞不同時間。提取細胞總 RNA,采用定量 PCR的方法,檢測 IL-6的mRNA水平。低劑量的H2O2(0.2 mmol/L)就可以引起IL-6表達的改變,并且隨著劑量的增加,其變化程度逐漸加大(圖1A)。H2O2作用6h后就可以檢測到IL-6 mRNA水平的明顯升高,在 18 h時達到峰值(圖1B)。此外,本實驗觀察了H2O2對3T3-L1脂肪細胞合成及分泌IL-6的作用。收集3T3-L1脂肪細胞在不同時間點的條件培養液,采用夾心 ELISA及多重免疫分析的方法檢測 IL-6在培養液中的水平。結果顯示,IL-6在H2 O2作用6h后就升高到對照組的4倍,到18h即升高到對照組的7倍(圖1C)。

圖1 H2 O2升高 3T3-L1脂肪細胞 IL-6的水平

2 H2O2影響 IL-6表達的可能信號轉導通路為了探討 H2 O2對 IL-6的調節機制,分化的3T3-L1脂肪細胞用或不用蛋白激酶抑制劑預處理 30 min,其后H2O2(0.5 mmol/L)作用 24h。提取細胞總 RNA,用定量 PCR的方法檢測 IL-6的mRNA表達水平。蛋白激酶抑制劑包括:Akt抑制劑(Ak tinhibitor,20μmol/L)、ERK1/2抑制劑(PD98059,50μmol/L)、JAK/STAT 抑制劑(AG490,25μmol/L)、JNK抑制劑(SP600125,10μmol/L)及p70S6K抑制劑(Rapamycin,RA,1μmol/L)。Akt抑制劑部分抑制H2O2引起的IL-6的升高(圖2A)。為了排除 Akt抑制劑的非特異性作用,本實驗用一種表達無活性 Akt(Dominant negative Akt,DN-Akt)的重組病毒感染3T3-L1脂肪細胞(200 pfu/cell),因為這種無活性 Akt的表達可以競爭抑制細胞內野生型Akt的作用。之后,再將感染了病毒的細胞用 H2O2(0.5 mmol/L)刺激 24 h。由圖2A可見,DN-Akt與Akt抑制劑有類似的作用。ERK1/2抑制劑(PD98059,50μmol/L)完全逆轉H2O2引起的IL-6的升高(圖2B)。AG490是 JAK/STAT信號通路的抑制劑,僅能部分逆轉 H2O2對 IL-6表達的上調(圖2C)。本實驗并沒有觀察到 JNK抑制劑(SP600125,10μmol/L)在 H2O2調節 IL-6表達過程中的作用(圖2D)。p70 S6K抑制劑(Rapamycin,RA,1μmol/L)單獨作用于3T3-L1脂肪細胞時,可以輕度升高IL-6的mRNA水平,而且更加劇了H2O2上調IL-6的作用(圖2E)。以上結果表明:Akt、JAK/STAT及ERK1/2參與H2O2對于IL-6的調節過程中。

圖2 一些蛋白激酶對 3T3-L1脂肪細胞產生脂聯素的影響

討 論

氧化應激在肥胖、糖尿病及與其相關的一系列疾病的發生、發展中占有重要的地位。目前已知,聚集的脂肪組織中過多產生 ROS可以引起多種脂肪細胞分泌因子的異常表達[4],但其具體的機制并不清楚。我們的實驗首先證實,H2O2作為一種重要的氧自由基,上調脂肪細胞的IL-6,并且具有濃度和時間依賴性。進而,對其可能的信號轉導通路進行了初步篩查。

MAPKs(mitogen activated protein kinase)是一個蛋白激酶的大家族,它參與到多種病理生理變化中,尤其在啟動細胞的應激反應、細胞增殖、分化及凋亡等方面占有重要的地位。它的三種最為重要的信號通路包括: ERK1/2、JNK1/2/3及p38(p38α/β/γ)MAPKs。以前的報道表明,在多種細胞中,氧自由基可以激活MAPKs[5]。本實驗的結果表明 ERK1/2的抑制劑完全阻斷了H2O2上調 IL-6的表達(圖2B)。JNK的抑制劑對H2O2引起的IL-6的變化并沒有明顯影響(圖2D),p38MAPK抑制劑的作用也并沒有得出比較肯定的結果。這些提示 JNK和p38MAPK可能并沒有參與到 H2 O2對 PAI-1的調節中。

Akt是一種具有多效性的信號分子,它是一種胰島素信號轉導通路及細胞增殖過程中重要的介導物。本實驗發現,在 3T3-L1脂肪細胞中,H2O2作用15min就可以檢測到 Akt明顯的磷酸化激活,這與在其他細胞,如:NIH 3T3成纖維細胞、人胚胎腎 293細胞及HeLa細胞中的報道相一致[6]。提示Akt的激活參與到脂肪細胞對H2 O2的反應中。雖然Akt抑制劑僅能部分抑制 H2 O2導致的IL-6表達的升高(圖2A),但它有可能也參與H2O2對 IL-6的調節。

p70S6K是PI3K的重要的下游信號分子,PI3K/p70S6K通路的激活影響細胞的蛋白質合成,而且對于細胞的生長有重要的意義,如,心肌細胞在輕度氧化應激情況下出現肥大與心肌細胞 p70S6K激活有關[7]。p70S6K的抑制劑 Rapamycin(RA)不但沒有反轉,反而更加劇H2 O2上調IL-6作用(圖2E),這有幾種可能的解釋:首先,可能 p70S6K的激活對于IL-6的表達是一種抑制因素;其次,Rapamycin可能具有其他非特異性的作用,比如它可能影響了其他的信號分子,這種作用也可能是增加 H2O2誘導的IL-6輕度上調的原因之一。通過對于p70S6K抑制劑作用的分析,使我們注意到,在使用化學性的抑制劑進行實驗時,必須要考慮到其可能存在的非特異性作用。因此,除了在實驗中要注意對照組的設置以外,對于很多結論最好需要用其他的方法進行進一步的證實。如本實驗中,每一種抑制劑都設立了抑制劑單獨作用的對照組。為了進一步肯定結論,本實驗還將一種表達無活性 Akt的病毒感染脂肪細胞,從而競爭抑制 Akt的活性,并與Akt化學抑制物的作用相比較,這樣就有效的克服了僅應用化學抑制劑的局限性。

JAK/STAT信號通路可以被細胞內的ROS及外源性H2 O2所激活。在本實驗中,JAK/STAT抑制劑則可以將其完全逆轉(圖2C),由于JAK是 STAT3的上游分子,因此 STAT3磷酸化水平的升高提示了JAK/STAT通路可能被激活,提示其參與H2O2對于IL-6的調節。

綜上所述,H2O2可能通過活化 Akt、JAK/STAT及ERK1/2多種信號轉導通路,劑量依賴性及時間依賴性地上調PAI-1。這為進一步深入研究脂肪分泌因子的調節機制提供了重要的線索,對于預防及治療肥胖及其并發癥提供了新的靶點。

[1] Yudkin JS,Kumari M,Humphries SE,etal.Inflammation,obesity,stress and coronary heart disease:is interleukin-6 thelink?[J].Atherosclerosis,2000,148(2):209.

[2] Mohamed-Ali V,Pinkney JH,Coppack SW.Adipose tissue as an endocrine and paracrine organ[J].Int J Obes Relat Metab Disord,1998,22(12):1145.

[3] Furukawa S,Fujita T,Shimabukuro M,etal.Increased oxidative stress in obesity and its impact on metabolic syndrome[J].JClin Invest,2004,114(12):1752.

[4] 陳寶瑩,魏經國,王 瑋,等.氧自由基對脂肪細胞中脂聯素表達的下調作用[J].心臟雜志,2008,20(2):142.

[5] Clerk A,Michael A,Sugden PH.Stimulation of multiple mitogen-activated protein kinase sub-families by oxidative stress and phosphorylation of the small heat shock protein,HSP25/27,in neonatal ventricular myocytes[J].Biochem J,1998,333(Pt 3):581.

[6] Shaw M,Cohen P,Alessi DR.The activation of protein kinase B by H2O2 or heat shock is mediated by phosphoinositide 3-kinase and not by mitogen-activated protein kinase-activated protein kinase-2[J].Biochem J,1998,336(Pt 1):241.

[7] Tu VC,Bahl JJ,Chen QM.Signals of oxidant-induced cardiomyocyte hypertrophy:key activation of p70 S6 kinase-1 and phosphoinositide 3-kinase[J].J Pharmacol Exp Ther,2002,300(3):1101.