誘導血紅素氧合酶-1對大鼠肝臟缺血再灌注的影響

西安交通大學醫學院第一附屬醫院(西安 710061)

呂颯美* 吳友偉* 薛 揮△

血紅素氧合酶-1(HO-1)是生物體內催化血紅素分解過程中一種關鍵的限速酶,具有重要的生物作用。近年來發現,其在細胞應激及組織損傷防治中發揮著一定的作用,我們在成功建立大鼠肝臟缺血再灌注損傷模型基礎上,探討 HO-1是否可以減輕肝臟缺血再灌注損傷及其相關作用機制。

材料和方法

1 實驗材料 實驗動物:選用西安交大醫學院動物實驗中心提供的SD雄性大鼠 77只,體重200～275g。主要試劑:Hemin Znpp均購于美國Sigma公司;SOD測定試劑盒及MDA測定試劑盒購于南京建成生物工程研究所,兔抗大鼠caspase-3多克隆抗體及DAB顯色試劑盒購于武漢博士德生物工程有限公司。

2 缺血再灌注模型建立 大鼠禁食 12h后,氯胺酮80mg/kg腹腔內注射麻醉。建立原位肝I/R模型:取上腹正中切口,入腹后分離肝十二指腸韌帶,充分顯露第一肝門部,用無損傷血管夾夾閉肝中葉和左外側葉的肝動脈、門靜脈,以造成70%的肝臟缺血模型,但不阻斷肝右葉、尾狀葉血流,以防胃腸道淤血及再灌注后腸道內的細菌和內毒素回流入肝臟對實驗結果造成的不良影響。當缺血30min后,松開血管夾,恢復缺血肝葉的入肝血流。N組僅剖腹取血及肝組織,S組入腹后只游離肝門血管,不阻斷肝門血供,于術后第 6h、12 h取血及肝組織;I/R組及I/R+hemin組、I/R+Zn PP組均進行I/R手術,并分別再灌注后第6h、12h處死動物,取血、切取肝左葉組織,分別用于各項指標測定、組織學檢查。

3 實驗分組 實驗動物分為5組,每組6只。①正常組(N);②假手術組(S);③手術組(I/R):游離肝門血管,分清供應肝左葉和中葉的肝動脈和門靜脈,肝臟缺血 30min,再灌注 6h和12h;④手術給藥組(I/R+hemin),術前 24h、12h大鼠腹腔注射 hemin(氯鐵血紅素),每次 30μmol/kg體重,余同手術組;⑤手術給藥組(I/R+ZnPP),術前 24h、12h大鼠腹腔注射ZnPP,每次 10μmol/kg體重;其余各組予等量生理鹽水腹腔注射。其中S組、I/R組、I/R+hemin組和I/R+ZnPP組再各分為缺血再灌注后 6h及12h兩個亞組。

4 觀察項目 ①血清肝臟酶學指標檢測:手術后6h、12h下腔靜脈取血分離血清用全自動生化分析儀檢測血清谷草轉氨酶(AST)、谷丙轉氨酶(ALT)。②錳超氧化物歧化酶(MnSOD)、丙二醛(MDA)的測定。③免疫組化染色檢測肝組織caspase-3的表達,以細胞漿內呈現黃褐色顆粒為陽性細胞,用Motic Med 6.0醫學病理圖像分析系統對圖象進行采集和分析?；叶戎禂抵翟叫?表明陽性表達越多。

5 統計學方法 采用SPSS15.0軟件進行統計學分析,實驗數據用均數±標準差(±s)表示,各組間比較進行單因素方差分析(One-way ANOVA),P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 各組大鼠血清 ALT、AST檢測結果 見表1,表2。肝臟缺血再灌注后I/R組與S組相比,術后6h和12h時血清 ALT、AST明顯增高(P＜0.01),術前給予 hemin,則在再灌注 6h、12h時,血清ALT、AST均比同期 I/R組血清ALT、AST水平降低(P＜0.01),術前給予Zn PP,則在再灌注6h、12h時,血清ALT、AST均比同期 I/R組血清 ALT、AST水平增高 (P＜0.01)。

表1 各組大鼠血清 ALT活性(U/L,±s)

表1 各組大鼠血清 ALT活性(U/L,±s)

注:a P＜0.01vs N組及S組,b P＜0.01 vs I/R組,c P＜0.01 vs I/R組。

表2 各組大鼠血清 AST活性(U/L,±s)

表2 各組大鼠血清 AST活性(U/L,±s)

注:a P＜0.01vs N組及S組,b P＜0.01 vs I/R組,c P＜0.01 vs I/R組。

12h 222.66±28.391055.33±172.01a695.66±141.48b1523.83±208.30c

2 各組大鼠血清MnSOD、MDA的檢測結果 見表3,表4。缺血再灌注后,再灌注6h、12h時,I/R組血清MDA水平高于同期 S組(P＜0.01);給予hemin后,在I/R+hemin組和I/R組之間進行比較,發現再灌注6h、12h時,I/R+hemin組的血清 MDA水平低于同期I/R組血清 MDA水平(P＜0.05);給予 ZnPP后,在 I/R+ZAPP組和I/R組之間進行比較,發現再灌注 6h、12h時,I/R+ZnPP組的血清MDA水平高于同期I/R組血清 MDA水平(P＜0.05);I/R組和S組相比,在再灌注 6h、12h時,I/R組大鼠血清 MnSOD水平均比同期 S組降低(P＜0.05);I/R+hemin組與I/R組比較,發現再灌注 6h、12h時,I/R+hemin組的血清MnSOD水平高于同期 I/R組(P＜0.05);I/R+Zn PP組與I/R組比較,發現再灌注 6h、12h時,I/R+ZnPP組的血清MnSOD水平低于同期 I/R組(P＜0.05)。

3 肝組織caspase-3免疫組化染色結果 見表5。肝臟缺血再灌注后6h、12h時,I/R+hemin組與同期I/R組比較,發現 I/R+hemin組caspase-3表達減少(P＜0.05),I/R+ZnPP組與同期 I/R組比較,發現 I/R+Zn PP組 caspase-3表達明顯增多(P＜0.01)。

表3 各組大鼠血清MDA水平(nmol/ml,±s)

表3 各組大鼠血清MDA水平(nmol/ml,±s)

注:a P＜0.01vs N組及S組,b P＜0.05vs I/R組(6h),c P＜0.01 vs I/R組(12h),d P＜0.05 vs I/R組。

12h 9.90±2.4414.99±2.8910.49±2.5918.36±2.55

表4 各組大鼠血清MnSOD水平(U/ml,±s)

表4 各組大鼠血清MnSOD水平(U/ml,±s)

注:a P＜0.01vs S組,b P＜0.05vs S組,c P＜0.01vs I/R組,d P＜0.05 vs I/R組。

表5 各組大鼠肝臟免疫組化切片caspase-3圖像分析灰度值(±s)

表5 各組大鼠肝臟免疫組化切片caspase-3圖像分析灰度值(±s)

注:a P＜0.01vs N組及S組,b P＜0.05vs I/R組,c P＜0.01 vs I/R組。

討 論

肝臟 IR損傷是常見的臨床病理過程,各種原因引起的休克、肝臟手術、肝移植等都可以引起肝臟 IR損傷。IR損傷機制是復雜的,涉及氧自由基、細胞凋亡、核因子-κB(NF-κB)激活、前炎性細胞因子和粘附分子的釋放、細胞能量不足、內皮素與一氧化氮失衡、細胞內鈣超載等方面。國外學者[1]認為肝臟缺血再灌注損傷分為2個階段,在再灌注早期(2h內)氧化應激是其主要特征,枯否細胞釋放細胞因子及氧源性自由基(Oxygenderived free radicals,ODFR)。導致肝臟的急性損傷;再灌注后期(6～48h)是由中性粒細胞活化和聚集導致的炎性期,活化的中性粒細胞釋放炎性細胞因子、活性氧、彈性蛋白酶等加重肝細胞損傷[2]。

MDA是脂質過氧化的產物,常被用于細胞脂質過氧化損害的指標。錳超氧化物歧化酶(SOD)的基本功能是保護細胞免受氧化應激,通過岐化反應清除超氧自由基。本研究發現肝臟缺血再灌注后,hemin組ALT、AST均明顯降低,ZnPP組ALT、AST均明顯增高;另外,I/R與S組比較,血清 Mn SOD水平降低,MDA水平增高,說明 I/R后體內抗氧化能力受損,氧自由基產生增多,肝組織脂質過氧化損傷明顯,應用hemin組血清 MnSOD水平降低減少,MDA生成減少,應用 Zn PP組血清 MnSOD水平顯著降低,MDA生成明顯增加,以上說明HO-1可以提高機體抗氧化能力,具有減輕肝臟缺血再灌注所引起的脂質過氧化損害和保護肝細胞的作用。

caspase家族在介導細胞凋亡的過程中起著非常重要的作用,其中caspase-3是細胞凋亡過程中最主要的終末剪切酶,被稱為“凋亡的執行者”[3]。Sass等[4]證實HO-1在細胞因子和CD95所介導的肝損傷模型中,可以有效抑制肝細胞凋亡的損傷。Katori等[5]在研究大鼠心臟移植過程中發現,應用HO-1誘導劑鈷卟琳增加 HO-1表達,可引起抗凋亡基因 Bcl-2和Bag-1的表達,從而抑制移植心臟的細胞凋亡,而聯合應用 HO-1抑制劑鋅外琳則可逆轉鈷卟琳引起的抗細胞凋亡作用。本實驗亦發現肝臟缺血再灌注后,I/R組caspase-3的表達明顯高于S組,表明肝臟缺血再灌注中確實存在細胞凋亡,I/R+hemin組與I/R組比較caspase-3表達明顯減少,I/R+Zn PP組與I/R組比較caspase-3表達明顯增多,表明HO-1可以減少缺血再灌注后細胞凋亡。

HO是近年發現的在人體內多種組織和器官中存在的一種抗氧化酶,它是一種具有催化能力的應激蛋白,催化分解血紅素生成CO、膽綠素和自由鐵,具有抗細胞凋亡、抗氧化、傳導信號和調節免疫的作用。膽綠素及其還原產物膽紅素是體內豐富的抗氧化物質,Foresti等[6]在細胞培養液中加入膽紅素可明顯增強細胞抗氧化損傷能力,Fondevila等[7]在大鼠肝缺血在灌注動物實驗模型中證明膽綠素有增加門靜脈血流、膽汁分泌量、改善微循環、減輕肝細胞損傷的作用,并將大鼠缺血原位肝移植生存率從 50%提高至90%～100%。HO-1的產物鐵離子可誘導鐵蛋白的合成,Balla等[8]的研究顯示:鐵蛋白具有抗氧化損傷和細胞保護功能。

既往國外文摘[9,10]提示:缺血再灌注時所產生的多種氧化物質可通過促使細胞凋亡而在缺血再灌注損傷中發揮重要作用。本文結果與上述研究基本一致,由此推測,HO-1可能通過抗氧化損傷通路而抑制細胞凋亡,從而達到對肝臟缺血再灌注的保護作用,其中 HO-1的作用產物一氧化碳、膽綠素、膽紅素和鐵可能發揮著重要作用[11]。

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[4] Sass G,Soares MC,Yamashita K,etal.Heme oxygenase-1 and its reaction product,carbon monoxide,prevent inflammation-related apoptotic liver damage in mice[J].Hepatology,2003,38:909-18.

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[6] Foresti R,Goatly H,Green CJ,etal.Role of heme oxygenase-1 in hypoxia-reoxygenation:requirement of substrate heme to promote cardioprotection[J].Am J Physiol Heart Circ Physiol,2001,281:H1976-84.

[7] Fondevila C,Shen XD,Tsuchiyashi S,etal.Biliverdin therapy protects rat livers from ischemia and reperfusion injury[J].Hepatology,2004,40:1333-41.

[8] Balla G,Jacob HS,Balla J,etal.Ferritin: a cytoprotective antioxidant strategem of endothelium[J].JBiol Chem,1992,267:18148-53.

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