血管內皮生長因子在實驗性大鼠慢性中耳炎中耳粘膜組織中的表達

西安交通大學醫學院第二附屬醫院耳鼻咽喉科(西安710004)

王延輝 許 珉 田 鵬

血管內皮生長因子(VEGF)是血管內皮細胞高特異性的有絲分裂原,具有提高血管對血漿蛋白滲透性的能力,可參與多種炎性疾病發生發展過程。本實驗采用免疫組織化學方法對慢性中耳炎大鼠中耳粘膜組織VEGF的表達進行了觀察,并對其表達進行了半定量分析,為研究 VEGF在慢性中耳炎炎癥中的作用提供實驗依據。

材料和方法

1 主要試劑與設備 西安交通大學醫學院動物實驗中心健康成年SD大鼠 25只,體重220～250g,Preyer反射靈敏,耳鏡檢查正常;羊抗大鼠V EGF單克隆抗體,DAB顯色盒,S-P試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司);光學顯微鏡;1×108L-1金黃色葡萄球菌液由西安交通大學醫學院微生物教研室提供。

2 大鼠慢性中耳炎模型建立 25只大鼠均以右耳為實驗耳,左耳作正常對照,大鼠用速眠新(0.2～0.3ml)肌肉注射麻醉后,無菌條件下于右耳經鼓膜注射 1×108L-1的金葡菌液 100μl,左耳注入100μl無菌生理鹽水作為正常對照。在清潔安靜的飼養條件下喂養,觀察期間未給大鼠進行任何治療。注射滿1月后處死。大鼠麻醉后,開胸經左心室行升主動脈穿刺,生理鹽水快速灌注沖出血液,再用多聚甲醛,戊二醛快速低溫灌注后,緩慢滴注1h,取出并剪開雙側聽泡,置4℃冰箱2d,充分水洗,10%EDTA脫鈣2周。按常規石蠟定向包埋。

3 染色方法 水平位連續切片,隔5～7片取 1片鋪片。2張用于HE染色,5張用于VEGF免疫組化染色。免疫組化染色采用S-P法,嚴格按試劑盒說明書操作,DAB顯色后,切片脫水透明,中性樹脂封片?？瞻讓φ战M用 PBS代替一抗,結果為陰性。陽性對照采用試劑盒自帶切片。

4 結果判定標準 光鏡觀察 VEGF表達部位與表達程度,鏡下被染成棕色的部位為陽性表達,深棕色為強陽性表達,棕黃色或淺棕色為陰性,采用半定量計分法衡量染色強度:陰性記0分,弱陽性染色記1分,中等染色記 2分,強染色記 3分。在同等條件及400倍鏡下,每張切片均選取不相重疊的5個代表部位,分別衡量粘膜上皮細胞的染色強度,將 5個值平均后所得值為該標本測量結果。將大鼠中耳粘膜病變程度根據HE染色分為3級:Ⅰ級:鼓室粘膜和粘膜下組織水腫和炎細胞浸潤,粘膜杯狀上皮細胞胞核深染,并見新生的小血管組織、成纖維細胞,未見鈣化。Ⅱ級:中耳粘膜上皮下結締組織見均質紅染的玻璃樣變,纖維組織增生,壞死組織中發生鈣化。Ⅲ級:鈣化的范圍進一步擴大,玻璃樣變物質減少,其周圍見大量纖維組織增生,修復的纖維層方向紊亂,成骨細胞增生,可見新生的骨組織。

4 統計學處理 實驗數據用均數±標準差表示,用 SPSS13.0統計軟件包進行統計學分析,表達量的差異用成組設計兩樣本均數比較的t檢驗,等級資料的差異用秩和檢驗,檢驗水準a=0.05(雙側),P＜0.05為有統計學意義。

結 果

1 手術顯微鏡下觀察鼓膜及中耳 大鼠空白對照耳(n=25)見鼓膜光滑透亮,富含血管紋的錘骨柄清晰可見,鼓室內粘膜呈淡粉紅色,聽泡骨壁薄而光滑,未見鈣化。實驗耳中5耳見鼓膜稍充血,透過鼓膜可見鼓室內少許黃色滲液。其余20耳均出現鼓膜穿孔,殘留鼓膜略充血。聽泡骨壁增厚粗糙,鼓室內見大量淡黃色粘稠分泌物,用棉拭子將分泌物擦拭干凈后,鼓室粘膜充血水腫,明顯增厚。其中2耳鼓室腔可見鈣化斑。

2 免疫組化染色結果 正常大鼠中耳粘膜VEGF表達較弱,主要表達于成纖維細胞、血管內皮細胞胞漿和膠原基質。慢性中耳炎大鼠中耳粘膜存在彌漫性強陽性表達,VEGF陽性產物定位于細胞胞漿,胞核無著色,陽性細胞聚集成團,排列密集。免疫浸潤細胞、單核細胞、巨噬細胞和肥大細胞胞漿內可見弱陽性表達。用SPSS軟件配對t檢驗,t=25.50,二者有明顯差異(P＜0.05)。隨著炎癥程度的增加,VEGF在中耳粘膜中陽性表達強度增加,進一步作兩兩比較發現不同級別之間差異均有統計學意義(兩兩組間比 P均＜0.05)。

表1 VEGF在實驗組及對照組中耳粘膜中表達

表2 VEGF在實驗組中耳粘膜中表達

討 論

研究慢性中耳炎發病機制,尤其是細胞因子在慢性中耳炎中的作用,已成為研究熱點[1～3]。但是由于臨床操作上的局限性,在人體內難以檢測細胞因子在中耳炎表達的過程。比較解剖學的研究結果表明,在實驗動物中,大鼠的中耳解剖結構與人的最為相似,本研究從組織學上證明了已成功建立了大鼠慢性中耳炎的模型。

血管內皮生長因子是一種特異地作用于血管內皮細胞的多功能細胞因子,有誘導血管生成,增加血管通透性等作用。VEGF可增加血管通透,主要是對毛細血管后靜脈和小靜脈施以影響。VEGF增加血管通透性的作用十分強烈,效應是組織胺作用濃度的5萬倍[4]。目前認為:(1)炎癥誘導 VECF的表達,從而導致微血管的生長。(2)另一些學者證實VEGF通過合成血小板活化因子影響血管通透性,從而加重炎癥的滲出。另一方面,VEGF誘導加強炎癥反應[5]。

在中耳炎大鼠粘膜組織中VEGF的表達增強,而且部分炎細胞也參與合成和分泌,表明V EGF可能也參與組織的局部免疫反應。VEGF以自分泌和旁分泌方式特異地作用于血管內皮細胞,通過增加內皮細胞內囊泡器的功能發揮對毛細血管和小靜脈的特異性通透作用,這種作用極利于大分子物質如纖維蛋白原的通過,隨后發生的血漿外滲致細胞外基質增加,使中耳粘膜發生水腫。VEGF和炎癥程度的關系:隨著炎性程度的增加,VEGF的表達值有逐漸增加的趨勢,I、II、III級 VEGF的表達值之間差異有顯著性。顯示VEGF表達強度與中耳炎癥程度相關。

血管的改建是慢性炎癥的一個特征,血管生成有助于受損組織的修復,但持續異常的血管生成卻又促使炎癥遷延不愈。血漿持續外滲,細胞因子、趨化因子、基質金屬蛋白酶和炎性細胞的長期存在均不利于受損組織的修復。此外,促血管形成的相關因子大多與成纖維細胞有關,這些因子長期大量的產生會致使受損粘膜過度纖維化。而肉芽組織乃由旺盛增生的毛細血管及纖維結締組織和各種炎性細胞組成。張全安等[6]研究發現中耳肉芽組織是由潴留滲出液逐步轉變而來的,是中耳腔慢性滲出液長期積存的結果。所以推測VEGF在炎癥期促進肉芽組織的形成。

綜上所述,中耳炎發病機制是一個很復雜的過程,它同時有多種因素起作用,這些因素之間又存在相互關系,而新生血管形成在這其中起了重要作用。深入研究VEGF與慢性中耳炎的關系,有助于進一步了解其發病機制,并為中耳炎的治療提供一種新的可能途徑。

[1] Yellon RF,Leonard G,Marucha PT,etal.Charactcrization of cytokines present in middle ear effusions[J].Laryngoscopc,1991,101(2):165-169.

[2] 孫 斌,陳 鋼.腫瘤壞死因子和慢性中耳炎的關系[J].西安交通大學學報,2004,25(5):470-471.

[3] 劉建治,孔維佳.黏蛋白 MUC2,M UCSAC m RNA在分泌性中耳炎大鼠模型的表達 [J].福建醫科大學學報,2007,41(3):214-216.

[4] Johnson RB.Vesailar.vascular endothelial growth factor and progression of periodontal diseasea[J].Periodontol,1999,70(8):848-852.

[5] 曾啟新.血管內皮生長因子與牙周炎[J].中華醫學研究雜志,2003,3(12):1083-1085.

[6] 張全安,梁建民.滲出性中耳炎滲出液的病理轉化和肉芽組織形成 [J].臨床耳鼻咽喉科雜志,1999,13(1):8-11.