MMP9特異性錘頭狀真核表達載體的構建及其對子宮內膜異位癥細胞侵襲力的抑制作用*

西安交通大學醫學院第二附屬醫院婦產科(西安 710004)

彭慧霞 尉春艷 陳和瓊△ 吳 靜

子宮內膜異位癥(EM)是育齡婦女中常見病,發病率大約10%～15%,并有逐年升高趨勢,25%～50%的不孕患者有子宮內膜異位癥。最新研究表明,基質金屬蛋白酶-9(MMP9)可特異性降解ECM的主要成分Ⅰ型膠原,促使異位子宮內膜細胞植入,在子宮內膜異位癥發生機制中具有重要作用。核酶(Ribozyrne,RZ)是一種具有酶活性的小 RNA分子,能特異性地結合和切割靶基因的m RNA,從而抑制其表達。本研究采用核酶技術,構建了MMP9基因特異性錘頭狀核酶真核表達載體,并將其轉染 EM基質細胞,抑制其對 EM基質細胞的增殖作用,探討 MMP9基因特異性錘頭狀核酶對子宮內膜異位癥的治療作用。

材料和方法

1 材 料(1)組織標本來源:選取2008年1月至2008年5月西安交通大學醫學院第二附屬醫院婦產科收治的子宮內膜異位癥患者 20例,年齡25～35歲。所有患者術前至少 3個月無激素用藥史,術后均經病理檢查明確診斷。術中取患者典型的異位病灶進行原代子宮內膜異位癥細胞培養。(2)主要材料和儀器:胎牛血清購自杭州四季青公司,DMEM培養基購自美國Gibco公司,MMP9蛋白抗體購自 Cell signaling公司,pcDNA3.1(+)真核表達載體、限制性核酸內切酶購自 TaKaRa公司。

2 方 法(1)設計核酶基因:在Genebank中查找 MM P9基因 mRNA序列,采用 RNA structure 4.6軟件對其二級結構進行計算機模擬分析,按照錘頭狀核酶設計原則(Symons模型[1]),人工設計 MMP9特異性的核酶基因序列。選擇MMP9基因 1200位點的GUU三聯體為核酶切割位點,催化活性中心選擇保守的22個核苷酸序列,在核酶基因序列兩端分別加上BamH I和EcoR I酶切位點及保護堿基。設計后的核酶基因序列為:(A):5'GCGGAATTCGA

GGAACACTGATGAGTCCGTGAGGACGAAACT GTATCCTGGATCCCGC3';(B):5'GCGGGATCCA GGATACAGTTTCGTCCTCACGGACTCATCAGT GTTCCTCGAATTCCGC3'。核酶基因由Invitrogen公司合成,命名為RZ基因。(2)核酶基因真核表達載體的構建:將載體 pcDNA3.1用 BamH I和EcoR I雙酶切,經質量分數為0.8%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定后,回收大片段。RZ基因用 BamH I和EcoR I雙酶切,經質量分數為2.6%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定后,回收大片段。將pcDNA3.1和RZ基因雙酶切產物加入等體積含有 T 4DNA連接酶的反應液,16℃連接 2h。將連接產物轉化 DH5α大腸埃希菌,涂布于含 100 0μg/ml氨芐青霉素鈉的LB平板上,篩選陽性克隆并擴增。抽提質粒并經 BamH I和EcoR I雙酶切,2.6%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定,命名為pcDNA3.1-RZ。(3)EM原代基質細胞的培養:手術室刮取子宮內膜標本,超凈臺內剪成約 1mm3后,用6ml 1.25 g/L膠原酶 IV消化 70～90 min,離心后用 D-8900重懸,用 200目和400目篩網 2次過濾后接種于75cm2flask中,2 h后換液,洗去多余的紅細胞和腺上皮細胞,置于37℃、5%CO2培養箱中。(4)質粒轉染及Western blot檢測:將EM基質細胞分為正常對照組,轉染空質粒組和轉染pcDNA3.1-RZ組,具體操作按脂質體 Lipofactamine 2000說明書進行。轉染穩定后用Western blot法對各組細胞內MMP9蛋白的表達進行檢測。(5)細胞體外侵襲能力測定:采用 transwell小室法。在下室中加入已培養過細胞的上清作為誘導劑。上下室間置 PVPF微孔濾膜,膜上鋪Matrigel基質膠,37℃放置30min。用不含胎牛血清的DMEM懸浮正常對照組、轉染空質粒組和轉染 pcDNA3.1-RZ組細胞,并將其加入對應的小室中,每個小室 8×104個。37℃、5%CO2的培養箱培養12h。取出小室,拭去膜表面的殘留細胞,結晶紫染色30min,光學顯微鏡下觀察侵襲至膜上的細胞,每孔計數 5個高倍鏡視野(×100)中的細胞數總和,求其平均值。以穿膜細胞數目的多少作為評價細胞侵襲能力強弱的指標。(6)統計學方法:采用t檢驗。

結 果

1 質粒鑒定 運用BamHI和EcoRI雙酶切,質量分數為2.6%的瓊脂糖凝膠電泳30min,可見插入的目的片段約 46bp,與預期一致(見圖1)。

圖1 核酶基因真核表達載體的鑒定

2 Western blot檢測 轉染pcDNA3.1-RZ的EM基質細胞中 MMP9蛋白的表達顯著低于正常對照組和轉染空質粒組(見圖2)。

3 細胞體外侵襲力 轉染pcDNA3.1-RZ組細胞穿過人工膜細胞數為25.2±3.4,明顯低于正常空白組、轉染空質粒組的59.3±4.3和58.6±3.8(P均＜0.05)。

圖2 Westen blot檢測MMP9蛋白的表達

討 論

子宮內膜異位癥雖然是一種良性病變,但是異位子宮內膜具有對卵巢等盆腔器官和腹膜的黏連、侵襲和轉移等類似腫瘤的生物學行為[2]。近來的研究發現,EM的內膜可能通過細胞外基質的作用使異位內膜更易于種植和侵襲腹膜及周圍組織。基質金屬蛋白酶(MMPs)是鋅依賴性的蛋白酶家族,其家族成員可以降解所有細胞外基質成份,破壞基底膜,排除細胞種植屏障。MMP9是MMPs家族中分子量最大的明膠酶,能降解細胞外基質中Ⅳ型、V型膠原和明膠這三種主要成份;并能促進血管內皮細胞的出芽,導致新生血管的形成;同時可通過與整合素的相互活化而加強細胞間的黏附作用,從而在子宮內膜細胞的異位黏附、種植和生長的過程中發揮重要作用[3,4]。目前研究也證明MM P9蛋白在 EM在位內膜的表達顯著高于正常子宮內膜[5]。因此我們推測,如果能抑制 MMP9蛋白的表達,可能能有效抑制子宮內膜異位細胞的生長和增殖。核酶是具有酶催化活性的小分子核酸(RNA)。它不僅可以像反義 RNA那樣與mRNA結合,阻斷其轉錄、剪切加工和翻譯復合體形成等環節,還能在m RNA中的特異位點將其切割,使其失去生物學功能。錘頭狀核酶由于結構簡單、易于設計、合成及轉移而受到人們廣泛關注。錘頭狀核酶由22nt的催化活性中心及2個互補的側翼序列構成,可特異性識別并切割 GUX三聯體(X:C、A、U)。但是,由于靶 RNA存在復雜的二級結構,并非所有的GUX三聯體都是理想的切割位點。因此,選擇合適的切割位點是充分發揮核酶切割效率的關鍵。選擇理想的靶位點需要考慮:①靶位點所在的序列具有重要的生物學功能;②選擇的位點及其周圍序列具有高度保守性;③三聯體應位于一個環狀結構上,有利于核酶接近底物;④具有高比例的A+U,有利于核酶與底物之間的退火,有利于提高核酶的催化周轉率[6]。本實驗應用計算機輔助法分析MM P9 mRN A的二級結構,依據以上原則選擇第1200位的GUU三聯體作為核酶的切割位點,設計并合成核酶基因,將其插入到 pcDNA3.1中,成功構建了針對MM P9基因的特異性錘頭狀核酶真核表達載體(pcDNA3.1-RZ)。我們將 pcDNA3.1-RZ轉染 EM基質細胞后發現,重組質粒可明顯抑制 EM基質細胞中MM P9蛋白的表達,Boyden小室法顯示轉染pcDNA3.1-RZ組的EM基質細胞的侵襲力明顯減弱,與轉染空質粒組和正常空白組相比具有統計學意義(P＜0.05)。因此,我們設計的pcDNA3.1-RZ重組質粒可有效切割 EM基質細胞內MMP9 mRNA,進而抑制 MMP9蛋白的表達,使其失去生物學活性,從而抑制異位子宮內膜細胞的侵襲性生長,為進一步的研究提供了細胞學基礎,為子宮內膜異位癥的治療提供了新的思路。

[1] Symons RH.Small catalytic RNAs[J].Annu Rev Biochem,1992,61:641-671.

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