survivin在結(jié)直腸癌中表達(dá)及與臨床病理特征的關(guān)系

河北北方學(xué)院附屬第二醫(yī)院普外科(張家口 075100)

魯 蓓 武 欣* 王琳冬△ 王淑強(qiáng)* 范 婕* 左東升* 白美玲* 張林西▲

結(jié)直腸癌是我國(guó)常見(jiàn)的惡性腫瘤之一。近年來(lái),其發(fā)病率有明顯升高、發(fā)病年齡提前的趨勢(shì)。凋亡是正常體細(xì)胞維持自穩(wěn)的重要保護(hù)機(jī)制之一。近年來(lái)發(fā)現(xiàn),凋亡蛋白家族抑制因子重要成員之一survivin,在成人組織中無(wú)表達(dá),而在人類多數(shù)惡性腫瘤組織如食管癌、乳腺癌、肺癌、膀胱癌等[1～4]中高表達(dá),并能強(qiáng)烈抑制細(xì)胞死亡。本研究采用流式細(xì)胞術(shù)及免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)結(jié)直腸癌(Colorectal carcinoma,CRC)及結(jié)直腸正常黏膜中 survivin的表達(dá)情況,并分析其表達(dá)與結(jié)直腸癌各種病理參數(shù)之間的關(guān)系,探討其在結(jié)直腸癌進(jìn)展和轉(zhuǎn)移中的作用,為結(jié)直腸癌浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移的預(yù)測(cè)、預(yù)后判斷提供理論依據(jù)。

材料和方法

1 臨床資料 收集河北北方學(xué)院醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室以及河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院2005年3月至2006年5月間手術(shù)切除的結(jié)直腸癌標(biāo)本 100例,同時(shí)選取結(jié)直腸癌遠(yuǎn)端病理證實(shí)組織學(xué)正常的黏膜 11例。患者術(shù)前均未經(jīng)過(guò)放、化療,且術(shù)后病理均確診為腺癌。其中,男性 41例,女性 59例,年齡 30～78歲,平均年齡58.3歲。發(fā)生部位:結(jié)腸癌46例,直腸癌54例;組織分化程度:高分化腺癌 52例,中分化腺癌 26例,低分化腺癌 11例,粘液腺癌 11例;有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組 48例,無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組 52例。連續(xù)切片,厚4μm,取 2～3張切片,其中 1張做常規(guī) HE染色,由兩位資深病理醫(yī)師進(jìn)行病理診斷復(fù)查。另一張用于免疫組化 S-P法檢測(cè) survivin蛋白表達(dá)。同時(shí)切40μm厚的組織片 5片,放入10ml的試管中,用于進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)。

2 主要試劑 兔抗人survivin多克隆抗體(Santa Crus)、羊抗兔IgG-FITC(Lab vision Neomarkers公司產(chǎn)品)、SP-9000試劑盒及DAB顯示劑等均購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè) 首先制備合格的單細(xì)胞懸液,按[5]方法進(jìn)行。然后進(jìn)行細(xì)胞survivin表達(dá)的間接免疫熒光標(biāo)記:取單細(xì)胞懸液 1×106/ml,加入兔抗人COX-2單克隆抗體工作液 0.lml,室溫孵育 30min,加入PBS10ml洗滌一次,棄上清,加入羊抗兔 FITC-IgG二抗工作液 100μl,避光室溫孵育 30min,加入PBS 10ml離心同上,棄上清以除去未結(jié)合的熒光二抗,上機(jī)檢測(cè)前加入PBS 0.1ml經(jīng)500目銅網(wǎng)過(guò)濾后上機(jī)檢測(cè)。同時(shí)設(shè)一抗或二抗的本底對(duì)照和陰性對(duì)照。采用美國(guó)Beckman Coulter公司生產(chǎn)的Epics-XL II流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè),應(yīng)用 Expo 32 ADC軟件進(jìn)行免疫熒光數(shù)據(jù)分析。檢測(cè)前調(diào)整儀器 CV值在 2%以內(nèi)。

4 survivin蛋白免疫組化 S-P法染色 石蠟切片,常規(guī)脫蠟至水。按常規(guī)S-P法進(jìn)行染色,survivin一抗進(jìn)行 1∶100稀釋。DAB顯色,鏡下觀察顯色結(jié)果,待陽(yáng)性部位出現(xiàn)特異性顯色時(shí),自來(lái)水充分沖洗,終止顯色。蘇木素復(fù)染,充分水洗,常規(guī)梯度酒精脫水,二甲苯透明、中性樹(shù)膠封片。以 PBS液代替一抗作為陰性對(duì)照,以已知結(jié)直腸癌陽(yáng)性切片作為陽(yáng)性對(duì)照。

5 結(jié)果判定(1)由兩位資深病理醫(yī)師進(jìn)行雙盲閱片。survivin陽(yáng)性反應(yīng)為胞膜及胞漿的棕黃色染色。綜合染色強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞所占的百分比作為判斷標(biāo)準(zhǔn)[6],在 400倍視野下計(jì)數(shù) 500個(gè)細(xì)胞,其中染色深度以多數(shù)細(xì)胞的呈色反應(yīng)為準(zhǔn):淺棕色1分,棕黃色2分,深棕色 3分,不著色 0分;再將染色陽(yáng)性細(xì)胞的百分比打分:陰性為0分,陽(yáng)性細(xì)胞≤10%為1分,11%～50%為2分,51%～75%為3分,＞75%為4分,染色強(qiáng)度和陽(yáng)性百分比的乘積＞3分認(rèn)定為免疫反應(yīng)陽(yáng)性。(2)survivin表達(dá)流式細(xì)胞術(shù)定量分析:以流式細(xì)胞儀分析軟件給出的每例樣品的平均熒光強(qiáng)度計(jì)算熒光指數(shù)(Fluorescenceindex,FI),并以熒光指數(shù)表示 survivin基因蛋白表達(dá)的強(qiáng)弱,并進(jìn)行相關(guān)的數(shù)據(jù)分析。FI計(jì)算公式為:FI=(樣品基因蛋白表達(dá)熒光強(qiáng)度-正常樣品的熒光強(qiáng)度)/正常樣品的熒光強(qiáng)度。

6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。survivin蛋白表達(dá)的免疫組化結(jié)果進(jìn)行χ2檢驗(yàn)。survivin蛋白表達(dá)的流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行單因素方差分析。當(dāng)P＜0.05時(shí)認(rèn)為具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

結(jié) 果

1 survivin在結(jié)腸癌和正常結(jié)腸黏膜中的表達(dá)及與臨床病理特征的關(guān)系 免疫組化顯示survivin的陽(yáng)性表達(dá)為癌細(xì)胞胞漿出現(xiàn)明顯棕黃色。11例正常黏膜全部呈陰性;100例結(jié)直腸癌中68例呈陽(yáng)性,陽(yáng)性率為68.00%;兩組間survivin的表達(dá)有明顯差異(P＜0.05)(見(jiàn)表1)。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組survivin表達(dá)陽(yáng)性率為87.50%(42/48),無(wú)轉(zhuǎn)移組陽(yáng)性率為50.00%(26/52),無(wú)轉(zhuǎn)移組陽(yáng)性率顯著低于轉(zhuǎn)移組(P＜0.05);survivin的表達(dá)與結(jié)直腸癌患者的年齡、性別、腫瘤的發(fā)生部位以及分化程度無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)(見(jiàn) 表2)。

表1 survivin在結(jié)腸癌和正常結(jié)腸黏膜中的表達(dá)[n(%)]

表2 免疫組化檢測(cè)survivin表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系[n(%)]

表3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)survivin表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)survivin表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系 FCM結(jié)果顯示,survivin在結(jié)直腸癌中表達(dá)的FI值等于3.25±1.06,其表達(dá)明顯高于正常黏膜(FI值=1.00±0.25)。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組 survivin蛋白表達(dá)平均 FI值為3.11±1.19,顯著高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的2.26±1.38,兩組間存在顯著差別(P＜0.05);高、中、低分化及粘液癌組的survivin蛋白表達(dá)平均 FI值分別為3.16±1.39、3.20±1.04、3.32±0.48和3.31±1.06,四組間無(wú)顯著差別(P＞0.05)(見(jiàn)表3);正常黏膜組survivin蛋白表達(dá)分別與其它各組間存在顯著差異(P＜0.01)(見(jiàn)表4)。survivin蛋白的表達(dá)與結(jié)直腸癌患者的年齡、性別、腫瘤的發(fā)生部位無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

表4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè) survivin在結(jié)腸癌與正常黏膜的表達(dá)

討 論

結(jié)直腸癌是我國(guó)消化道最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一,腫瘤浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移是患者死亡的重要原因。survivin蛋白除與抑制凋亡和保護(hù)細(xì)胞存活外,還參與腫瘤血管形成,對(duì)腫瘤的浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移等有關(guān)。1997年Sheehan等[7]從人類基因組文庫(kù)中通過(guò)雜交篩選獲得。survivin是凋亡抑制基因,屬于凋亡蛋白抑制家族,它定位于染色體 17q25,是凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis protein,IAP)家族中最小的成員。一般而言,survivin除了在胚胎和胸腺中有微弱表達(dá)外,其他組織均未檢測(cè)到,但 survivin在幾乎所有的人類癌組織中都有表達(dá)。survivin在腫瘤細(xì)胞的定位不同,功能不同。位于胞漿中主要與凋亡有關(guān),而位于核中的survivin多與腫瘤細(xì)胞的增殖有關(guān)[8,9]。本研究應(yīng)用免疫組化檢測(cè)發(fā)現(xiàn),其主要位于細(xì)胞漿中,而細(xì)胞核沒(méi)有明顯表達(dá)。說(shuō)明其在結(jié)腸癌發(fā)生及進(jìn)展中可能主要起到抑制凋亡的作用。

survivin作為近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一個(gè)重要凋亡抑制因子,它在結(jié)直腸癌的生長(zhǎng)與轉(zhuǎn)移中可能發(fā)揮著重要作用。survivin可以調(diào)節(jié)線粒體內(nèi)膜電壓依賴的離子通道,減少釋放細(xì)胞色素C;還可以直接與caspase-3和caspase-7相結(jié)合,使caspase的活性降低而抑制凋亡。研究發(fā)現(xiàn),survivin在食管癌、胃癌、肺癌、膀胱癌、乳腺癌等多種腫瘤組織中呈高表達(dá),與多種惡性腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn),survivin在結(jié)直腸癌中68.00%陽(yáng)性表達(dá),而正常結(jié)直腸黏膜中無(wú)survivin表達(dá),這與Kawasaki等[10]研究結(jié)果相一致;同時(shí)流式檢測(cè)結(jié)果也說(shuō)明在結(jié)腸癌中其表達(dá)顯著高于正常黏膜。提示 survivin可能在結(jié)直腸癌的發(fā)生或進(jìn)展中有重要意義。

survivin的表達(dá)與腫瘤的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。從本研究免疫組化結(jié)果可以看出,有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的陽(yáng)性率顯著高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組;但是與患者的性別、年齡、癌發(fā)部位及分化程度等無(wú)關(guān)。FCM結(jié)果也顯示,淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組survivin蛋白表達(dá)平均 FI值顯著高于無(wú)轉(zhuǎn)移組,與免疫組化結(jié)果相一致。提示survivin高表達(dá)的結(jié)直腸癌更易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移,患者可能預(yù)后較差。而且,高、中、低分化及粘液癌組的survivin蛋白表達(dá)平均 FI值分別為3.16±1.39、3.20±1.04、3.32±0.48和3.31±1.06,組間無(wú)顯著差別;但是正常黏膜組survivin蛋白表達(dá)平均 FI值僅為1.00±0.25。提示survivin的高表達(dá)可能是發(fā)生于結(jié)直腸癌發(fā)生的早期階段。

FCM檢測(cè)結(jié)直腸癌標(biāo)本中survivin的表達(dá),所得結(jié)果與免疫組化方法的結(jié)果相一致,一方面說(shuō)明兩種檢測(cè)方法都在檢測(cè)中比較可靠、方法成熟;另一方面,隨著 FCM技術(shù)的推廣,該技術(shù)已比較成熟,操作相對(duì)簡(jiǎn)單、快速且結(jié)果比較客觀。FCM在腫瘤研究及臨床檢測(cè)等方面表現(xiàn)出更明顯的優(yōu)越性。

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