FISH在唐氏綜合征產前診斷中的應用價值

第四軍醫(yī)大學西京醫(yī)院婦產科(西安 710032)

陳必良 張建芳 趙海波 燕 鳳 宋 暉 劉淑娟

唐氏綜合征(Down syndrome)又稱 21三體綜合征,是由于21號染色體數(shù)目異常引起的常染色體病,新生兒發(fā)病率為1/700～1/800。臨床表現(xiàn)為智力低下、精神體格發(fā)育遲滯,并伴有其他嚴重的先天缺陷[1]。目前,對于此病尚無有效的治療手段。因此,在孕期能及早、準確的做出診斷、防止患兒出生是降低患病率的重要措施。通過取絨毛、羊水或臍血培養(yǎng),對分裂中期細胞進行核型分析是目前產前確診唐氏綜合征的常規(guī)方法。但該方法耗時長,且培養(yǎng)過程中易因污染或操作技能等原因導致失敗而無法分析。我們應用近幾年發(fā)展起來的熒光原位雜交(Fluorescence in situ hybridization,FISH)技術對40例羊水和10例絨毛進行FISH分析,探討其在唐氏綜合征產前診斷中的應用價值。

資料與方法

1 標本羊水:共 40例,全部為在我科就診的有產前診斷指征(包括唐氏篩查陽性、高齡、胚胎發(fā)育遲緩、育有 21三體兒等)的孕婦,年齡 24～44歲,孕齡16～32W。B超引導下經腹部抽取羊水15ml,10ml細胞培養(yǎng),5ml羊水準備FISH,羊水細胞離心后備用。絨毛:10例孕 50～70d,有產前診斷指征,年齡在 25～34歲的孕婦,其中 3例育有 21三體兒,5例有不良孕產史(反復流產、畸胎、死胎、胎兒先心病等),2例為停止發(fā)育的胚胎組織。經B超定位后無菌操作,經陰道取少量絨毛。

2 試劑和設備 甲酰胺,汕頭市西隴化工廠;NP-40,美國 Amresco公司;膠原酶 B,SIGM A公司;胃蛋白酶,SIGMA P7000;標記紅色熒光的DSCR2探針雜交于21q22的唐氏關鍵區(qū),標記綠色熒光的對照探針 DLEU1雜交于13q14,以及DAPI染料均由金菩佳公司提供。熒光顯微鏡,奧林巴斯 BX51;圖像分析系統(tǒng),美國 Applied Imaging公司;微量加樣器,德國Eppendoff公司;水浴箱,上海東星建材實驗設備有限公司。

3 方 法(1)羊水標本制備:羊水 2～5ml,離心1000 rpm,10min,去上清,留沉淀 0.2m1。離心管中加入5ml預溫的0.075mol KCl,在 37℃水浴中低滲10min。離心,1000 rpm l0min,去上清。加入新配制的固定液(甲醇∶冰醋酸=3∶1)固定 30min。滴片,自然干燥后置-20℃冰箱凍存。(2)絨毛標本制備:絨毛5～10mg經生理鹽水清洗后,在解剖顯微鏡下仔細挑選絨毛枝。在絨毛中加入0.5%胰蛋白酶 /PBS液,在37℃中處理 30min。用 RPMI 1640培養(yǎng)液洗滌絨毛10min。加入0.075mol KCl。在 37℃中低滲 15min。60%冰醋酸解離。標本置固定液中處理30min。滴片,自然干燥后-20℃保存?zhèn)溆谩?3)雜交程序:將制備好的羊水、絨毛玻片自冰柜中取出,依次放入70%、85%、100%乙醇中脫水。室溫干燥。預處理好的玻片置73℃,70%甲酰胺 /2×SSC中5min。兩種探針混合液 10μl加在玻片的靶區(qū)域,蓋上蓋玻片,避免產生氣泡(暗室中操作)。橡皮水泥將蓋玻片封好。置暗濕盒中 37℃雜交過夜。(4)雜交后清洗(在暗室中):去掉蓋玻片。0.4×SSC/0.3%NP-40,在 71℃中洗 2.5 min。2×SSC/0.1%NP-40,在室溫下洗 1min?？諝庵懈稍?。加6μl DAPI復染。在靶區(qū)域加蓋玻片。室溫15min后即可觀察。(5)結果判讀:在鏡下觀察雜交效果,每例標本計數(shù) 100～200個細胞,記錄雜交信號數(shù)目并采集圖像。要求細胞核膜必須完整,核內雜交信號明亮清晰無重疊,信號彌散及微弱均不作統(tǒng)計。如果出現(xiàn)2個或3個熒光信號,兩個位點之間距離大于單個信號的直徑以上,且熒光強度相近,計為含有2條或3條染色體。如果兩個信號之間的距離小于1個信號的直徑則計數(shù)為1條染色體。對于21三體的確認以≥60%的細胞顯示 3個紅色雜交信號為診斷標準。

結 果

1 羊水細胞分析結果 40例中羊水中,發(fā)現(xiàn) 2例21三體綜合征。其中1例為標準型21三體,來自一位26歲的孕婦,本次為第三次妊娠,超聲發(fā)現(xiàn)胎兒為先天性心臟病,完全型房室管畸形合并房間隔卵圓孔未閉。另1例為嵌合體,來自一位 40歲的孕婦,超聲發(fā)現(xiàn)胎兒多發(fā)性畸形。FISH圖片見附圖。其余 38例均正常。與染色體核型分析完全一致。

附圖 羊水細胞 FISH檢測照片

2 絨毛標本分析結果 10例絨毛標本 FISH分析沒有發(fā)現(xiàn)21和13號染色體數(shù)目異常。2例絨毛培養(yǎng)后沒有發(fā)現(xiàn)中期細胞,未能進行核型分析。其余7例核型分析結果與FISH分析結果相符。

討 論

羊水培養(yǎng)及核型分析已廣泛應用于染色體結構和數(shù)目異常的產前診斷,但是這一技術不僅需要繁瑣和長的培養(yǎng)周期,而且由于受多種因素影響,培養(yǎng)的最終結果并不一定能滿足核型分析的要求。FISH是近幾年來由細胞遺傳學、分子遺傳學及免疫學技術相結合而產生的一種新技術,在遺傳學領域里的基礎研究或應用學科中都日益受到關注。特異DNA探針可以與相應的染色體進行雜交,在細胞核中能觀察到獨立的特異信號。FISH技術與傳統(tǒng)的細胞遺傳學方法比較,最大的優(yōu)勢在于不僅可用于中期染色體的檢測,而且可以用于間期核染色體的檢查。因此FISH用于產前診斷染色體數(shù)目異常,具有極大的優(yōu)越性[2,3]。

我們采用的DSCR2探針,雜交于21q22的唐氏關鍵區(qū),DLEU1探針雜交于13q14。兩個探針可以互為對照,可同時檢測這兩個染色體的數(shù)目異常。而且唐氏綜合征主要是由于21q22.2-q22.3的額外復制造成。運用DSCR2特異性探針進行 FISH分析,不僅可以在未培養(yǎng)細胞間期核中快速、準確診斷典型的21三體,還可以在正常二倍體中檢測出部分三體型的患者,是進一步研究不明原因智力低下和更加準確產前診斷唐氏綜合征的可靠方法[4,5]。

我們對 40例羊水細胞和10例絨毛組織標本進行FISH分析,標本僅需用 2～5ml羊水或 5～10mg絨毛,24～48h即可作出診斷。實驗結果均與染色體分析相符。所以FISH技術的應用,不僅省去了細胞培養(yǎng)時間、縮短了診斷周期,又以快速、準確、靈敏度高、特異性強的突出特點彌補了長期以來僅依靠細胞遺傳學產前診斷的不足和局限性,減少了因培養(yǎng)失敗帶來的煩惱,是一種應用前景非常好的產前診斷技術。

[1] 梁永昌,陳 敏,劉嚴德光,等.產前診斷中常見染色體異常的快速診斷 [J].中國實用婦科與產科雜志,2008,24(02):98-101.

[2] 鄒 剛,段 濤.產前診斷胎兒非整倍體的分子生物學方法進展 [J].中國婦幼健康研究,2007,18(01):74-77.

[3] 田玉姣,岳天孚.唐氏綜合征的產前診斷分子技術研究進展 [J].國際婦產科學雜志,2008,35(01):12-15.

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