氯磷酸二鈉對急性壞死性胰腺炎大鼠肝損傷的影響

張建新 張勇 黨勝春 沙鑫 蔡華忠 陳敏 姜德立

·論著·

氯磷酸二鈉對急性壞死性胰腺炎大鼠肝損傷的影響

張建新 張勇 黨勝春 沙鑫 蔡華忠 陳敏 姜德立

目的探討氯膦酸二鈉對急性壞死性胰腺炎(ANP)大鼠肝損傷的保護作用。方法SD 大鼠48 只，按隨機表法分為對照組、ANP組和氯磷酸二鈉組。采用胰腺被膜下均勻注射5%牛磺膽酸鈉制作ANP模型。利用薄膜法制備包裹氯磷酸二納的脂質體。ANP組和氯磷酸二納組于制模后立即經尾靜脈分別注射空白脂質體和包裹氯磷酸二鈉的脂質體。制模后2、6 h分批處死動物，取血檢測血清淀粉酶(AMS)、丙氨酸轉氨酶(ALT)、天冬氨酸轉氨酶(AST)及IL-6、IL-12的含量，取肝臟和胰腺組織，觀察病理學變化。結果對照組、ANP組和氯磷酸二納組6 h點的ALT含量分別為(73±11)U/L、(257±33)U/L和(184±29)U/L；AST分別為(190±32)U/L、(590±70)U/L和(430±52)U/L；AMS為(814±80)U/L、(5031±471)U/L和(2843±236)U/L；IL-6為(26.7±5.7)pmol/L、(218.0±4.7)pmol/L和(112.3±8.0)pmol/L；IL-12為(4.2±1.0)pmol/L、(309.5±8.5)pmol/L和(153.7±6.3)pmol/L。ANP組和氯磷酸二納組上述血清指標均顯著高于對照組，而氯磷酸二納組的含量又較ANP組顯著降低(P值均lt;0.01)。氯磷酸二納組大鼠的胰腺及肝臟病理變化均較ANP組明顯減輕。結論靜脈給予脂質體包裹的氯磷酸二納對ANP大鼠的肝損傷具有一定保護作用。

胰腺炎，急性壞死性； 脂質體； 肝損傷； 氯磷酸二鈉； 枯否細胞

氯磷酸二鈉(clodronate)是一種人工合成的雙磷酸酯，它在體內形成具有毒性作用的ATP類似物，從而導致細胞內能量代謝障礙，引起破骨細胞凋亡，進而減輕破骨細胞對骨質的吸收[1]，多用于治療骨質疏松等引起的骨質改變。Shifrin等[2]應用脂質體包裹的氯磷酸二鈉干預急性壞死性胰腺炎(ANP)小鼠，結果胰腺局部及全身的炎癥反應明顯減輕。本文同樣采用脂質體包裹的氯磷酸二鈉干預ANP大鼠，觀察其對ANP并發的肝損傷的保護作用。

材料和方法

一、脂質體包裹的氯磷酸二納的制備

參照Van Rooijen等[3]的方法并加以改進。使用500 ml的梨形燒瓶，將 8 mg膽固醇溶解在10 ml含10%磷脂酰膽堿的氯仿中，37℃低真空，逐漸旋轉蒸餾除去氯仿，隨后用含0.6 mol/L的氯磷酸二鈉(上海偉進生物科技有限公司)的PBS液洗脫在燒瓶內壁上的乳白色磷脂膜，室溫下通氮氣保存2 h，在水浴聲波震蕩器中震蕩3 min，再在室溫下保存2 h使脂質體膨脹。使用無菌PBS清洗脂質體 2～3 次，最后用4 ml的PBS懸浮沉淀的脂質體，形成乳白色的膠體溶液。應用紫外分光光度法測定脂質體中氯磷酸二鈉的濃度及包封率，4 ml懸液大約含有 20 mg的氯磷酸二鈉，包封率約為6%。同法制備不含氯磷酸二納的脂質體。

二、實驗動物及分組

大鼠48只，體重350～400 g，清潔級，由江蘇大學動物中心提供。隨機分為對照組、ANP組和氯磷酸二鈉組。采用胰腺被膜下均勻注射5%牛磺膽酸鈉2 ml/kg體重(Sigma公司)制備ANP模型。氯磷酸二納組于造模后尾靜脈注射含氯磷酸二鈉的脂質體(4 ml/kg體重)；ANP組注射等量空白脂質體；對照組開腹后胰腺包膜下均勻注射等量生理鹽水。

三、血AMS、ALT、AST及IL-6、IL-12含量測定

制模后2、6 h分批處死動物，取血分離血清，自動生化分析儀測定血清AMS、ALT和AST含量。采用ELISA試劑盒(美國Invitrogen公司)測定血清IL-6、IL-12含量，嚴格按照說明書操作。

四、胰腺及肝臟組織形態學觀察

取6 h組胰腺頭部標本及肝臟右外葉，常規行病理學檢查。

五、統計學處理

結 果

一、大鼠血清AMS、ALT、AST及IL-6、IL-12的變化

ANP組和氯磷酸二納組血清AMS、ALT、AST水平和IL-6、IL-12含量均顯著高于對照組(P值均lt;0.01)，而氯磷酸二納組的含量又較ANP組顯著降低(P值均lt;0.01，表1)。

二、胰腺病理形態改變

對照組胰腺大體未見明顯改變；鏡下胰腺結構良好 (圖左1a)。ANP組6 h可見腹腔內血性腹水，胰腺充血水腫、出血、壞死；鏡下見胰腺壞死，大量炎性細胞浸潤 (圖左1b)。氯磷酸二納組胰腺病變較ANP組明顯減輕(圖左1c)。

三、肝臟病理形態改變

對照組大鼠肝臟色澤鮮紅；光鏡下肝小葉、匯管區未見明顯變化(圖右1a)。ANP組6 h見肝臟充血腫脹；鏡下見肝細胞凝固性壞死及脂肪變性，肝小葉匯管區內炎性細胞浸潤 (圖右1b)。氯磷酸二納組上述變化較ANP組有所減輕(圖右1c)。

討 論

肝臟是人體最大的巨噬細胞儲庫，在重癥急性胰腺炎(SAP)全身反應中的作用是比較獨特的。肝枯否(kupffer)細胞占整個集體單核巨噬細胞的50%，固定巨噬細胞群的80%～90%，是產生炎性細胞因子的主要效應細胞。研究證實，枯否細胞產生的IL-1β、IL-6、TNF-α等細胞因子是導致肝細胞損傷和肝臟功能障礙的直接原因[4-5]。阻止肝巨噬細胞IL-1β、IL-6、TNF-α的產生可以減輕肝的損害[6]。

表1 各組大鼠血清AMS、ALT、AST水平及IL-6、IL-12含量比較

注：與對照組比較，aPlt;0.01；與ANP組比較，bPlt;0.01

圖1(左列)對照組(a)、ANP組(b)和氯磷酸二納組(c)的胰腺病理改變；(右列)對照組(a)、ANP組(b)和氯磷酸二納組(c)的肝臟病理改變(HE ×20)

自上世紀60年代，脂質體就作為藥物載體開始應用。近年來隨著生物技術的發展，脂質體作為藥物載體的研究越來越受到人們的重視。由于脂質體具有類似細胞膜的結構，進入人體以后主要被內皮網狀系統吞噬而激活機體的自身免疫功能，并改變被包封藥物的體內分布，使藥物主要在肝、脾、 肺、骨骼等組織器官中蓄積[7]。Van Rooijen等[8]報道，靜脈內注射氯磷酸二納脂質體可以被巨噬細胞吞噬，其磷脂酶破壞脂質體的磷脂雙分子層，使藥物在細胞內釋放，從而誘導巨噬細胞的凋亡。本實驗結果顯示，給予脂質體包裹的氯磷酸二鈉能顯著降低ANP大鼠血中ALT、AST、AMS和IL-6、IL-12的含量，減輕胰腺及肝臟病損程度，說明其對ANP合并的肝損傷具有一定的保護作用，為臨床SAP的治療提供了一種新的思路和方法。

[1] Frith JC，M?nkk?nen J，Blackburn GM，et al.Clodronate and liposome-encapsulated clodronate are metabolized to a toxic ATP analog，adenosine 5′-(beta，gamma-dichloromethylene) triphosphate，by mammalian cells in vitro.J Bone Miner Res，1997，12:1358-1367.

[2] Shifrin AL，Chirmule N，Zhang Y，et al.Macrophage ablation attenuates adenoviral vector-induced pancreatitis.Surgery，2005，137:545-551.

[3] Van Rooijen N，van Kesteren-Hendrikx E."In vivo" depletion of macrophages by liposome-mediated "suicide" .Methods Enzymol，2003，373:3-16.

[4] Liu HB，Cui NQ，Li DH，et al.Role of Kupffer cells in acute hemorrhagic necrotizing pancreaatitis-associated lung injury of rats.World J Gastroenterol，2006，12:403-407.

[5] Pastor CM，Vonlaufen A，Georgi F，et al.Neutrophil depletion-but not prevention of kupffer cell activation-decreases the severity of cerulein-induced acute pancreatitis.World J Gastroenterol，2006，12: 1219-1224.

[6] Yang J，Denham W，Carter G，et al.Macrophage pacification reduces rodent pancreatitis-induced hepatocellular injury through down-regulation of hepatic tumor necrosis factor alpha and interleukin-1beta.Hepatology，1998，28: 1282-1288.

[7] Van Rooijen N，Sanders A.Liposome mediated depletion of macrophages:mechanism of action， preparation of liposomes and applications．J Immunol Methds，1994，174:83-93.

[8] van Rooijen N，Sanders A，van den Berg TK.Apoptosis of macrophages induced by liposome-mediated intracellular delivery of clodronate and propamidine.J Immunol Methods,1996，193:93-99.

2009-07-13)

(本文編輯：呂芳萍)

Protectiveeffectsoflipsomalclodronateonhepaticinjuryinratswithacutenecrotizingpancreatitis

ZHANGJian-xin，ZHANGYong，DANGSheng-chun，SHAXin，CAIHua-zhong，CHENMin，JIANGDe-li.

DepartmentofGeneralSurgery，AffiliatedHospital,JiangsuUniversity，Zhenjiang212001,China

ZHANGJian-xin，Email:dscgu@163.com

ObjectiveTo investigate the protective effect of lipsomal clodronate against hepatic injury in rats with acute necrotizing pancreatitis (ANP).Methods48 SD rats were randomly divided into control group, ANP group and lipsomal clodronate group, respectively. The models of ANP were established by injection of sodium taurocholate into the pancreatic capsule. Lipsomal clodronate was prepared by means of thin film. Blank liposomes and clodronate-containing liposomes was injected via caudal vein in ANP group and lipsomal clodronate group, respectively. The rats were sacrificed at 2, 6 h after ANP induction, the serum levels of ALT, AST and AMS, IL-6，IL-12 were measured, and pathologic changes of liver and pancreas were observed.ResultsAt 6 h, serum level of ALT was (73±11)U/L, (257±33)U/L and (184±29)U/L in control group, ANP group and lipsomal clodronate group, respectively; serum levels of AST were (190±32)U/L, (590±70)U/L and (430±52)U/L, respectively; serum levels of AMS were (814±80)U/L, (5031±471)U/L and (2843±236)U/L, respectively, serum levels of IL-6 were (26.7±5.7)pmol/L, (218.0±4.7)pmol/L and (112.3±8.0)pmol/L, respectively; serum levels of IL-12 were (4.2±1.0)pmol/L, (309.5±8.5)pmol/L and (153.7±6.3) pmol/L. The values in ANP group and lipsomal clodronate group were significantly higher than those in control group, while the values in lipsomal clodronate group were significantly lower than those in ANP group (Plt;0.01). Pathologic changes of liver and pancreas were significantly attenuated in lipsomal clodronate group.ConclusionsIntravenous liposomal clodronate could exert protective effects on the hepatic injury in rats with ANP.

Pancreatitis,acute necrotizing； Liposomes； Hepatic injury； Clodronate; Kupffer cells

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2010.02.009

國家自然科學基金資助項目(30772117)；江蘇省自然科學基金資助項目(BK2007096)；鎮江市社會發展基金項目(SH2008036)

212001 鎮江，江蘇省鎮江市江蘇大學附屬醫院普外科(張建新、張勇、黨勝春、沙鑫、蔡華忠)；江蘇大學化學化工學院(陳敏、姜德立)

張建新，Email:zhangjx@ujs.edu.cn