沉默SIRT1基因表達對胰腺癌細胞PANC1增殖和凋亡的影響

趙剛 崔靜 王春友

·論著·

沉默SIRT1基因表達對胰腺癌細胞PANC1增殖和凋亡的影響

趙剛 崔靜 王春友

目的應用RNA干擾技術沉默胰腺癌PANC1細胞的SIRT1基因表達，觀察其對細胞增殖和凋亡的影響。方法構(gòu)建靶向SIRT1基因表達的短發(fā)夾RNA(shRNA)真核表達質(zhì)粒pGC-shRNA，轉(zhuǎn)染胰腺癌細胞PANC1。設對照shRNA(shRNA-C)轉(zhuǎn)染組和未轉(zhuǎn)染對照組。實時定量PCR和免疫細胞化學法檢測轉(zhuǎn)染后細胞SIRT1 mRNA及蛋白的表達；MTT法檢測細胞的增殖率；ELASA法檢測細胞caspase-3和caspase-9活性；Western bloting檢測細胞Bax、Bcl-2蛋白表達。結(jié)果與未轉(zhuǎn)染組相比，shRNA組轉(zhuǎn)染后48 h，PANC1細胞SIRT1 mRNA及蛋白表達的抑制率分別為(76.2%±10.4)%和(80.1±11.6)%；細胞增殖抑制率為(45.1±6.5)%；caspase-3和caspase-9酶活性顯著增高；Bax蛋白表達上調(diào)，Bcl-2蛋白表達下調(diào)。結(jié)論應用RNA干擾技術能有效沉默PANC1細胞SIRT1基因的表達，其機制可能與caspasa酶活性升高及Bax表達上調(diào)、Bcl-2表達下調(diào)有關。

胰腺腫瘤； SIRT1； RNA，小分子干擾； 細胞增殖； 凋亡

沉默信息調(diào)節(jié)因子-2(silent information regulator 2，Sir2)基因最早發(fā)現(xiàn)于釀酒酵母中[1]，其在哺乳動物細胞中的同源基因Sirtuinl(silent mating type information regulation 2 homolog 1，SIRT1)介導多種影響細胞周期的轉(zhuǎn)錄因子和調(diào)節(jié)細胞代謝狀態(tài)，其主要功能是在應激條件下減少細胞凋亡或衰老，增加細胞自我修復和存活的概率[2-3]。但SIRT1對于具有無限生長能力的腫瘤細胞的功能尚不明確。本實驗應用RNA干擾技術沉默人胰腺癌PANC1細胞SIRT1基因的表達，觀察其對PANC1細胞生長增殖及凋亡的影響。

材料和方法

一、重組質(zhì)粒構(gòu)建與鑒定

針對SIRT1(NM_012238)靶基因序列CCTTCTGTTCGGTGATGAA(487-505)設計小發(fā)卡RNA(shRNA)，正義鏈為5′-AAGGAGTGGATTGTCGTC-CCGCACGAGTGTTAGGACAGGGGACGACAATCCACT-CCTTGTATAGACAGTGACCACTACCGCGCAAGGAGA-TCT-3′，反義鏈為5′-CTCGAGAAGGTATATTGCTGTTGACAGTGAGCGCACCTTCTGTTCGGTGATGAAAAG-TGAAGCCACAGATGTATTTCATCACCGAACAGAAGG-3′；同時設計無同源性的對照shRNA(shRNA-C)，正義鏈5′-GATCCGGTIATGTACAGGAACGCATTCAAGA-GATGCGTTCCTGTACATAACCTTTTTTGGAAA-3′，反義鏈5′-AGCTTTTTCCAAAAAGGTTATGTACAGGAA-CGCATCTCTTGAATGCGTTCCTGTACATAACCG-3′。以上引物兩端分別有BamH Ⅰ和Hind Ⅲ酶切位點，均由上海吉凱公司合成。經(jīng)95℃ 5 min退火，形成互補雙鏈DNA。

真核表達質(zhì)粒pGC-silencer-CRM30購于上海吉凱公司，該質(zhì)粒含CMV啟動子，編碼GFP報告基因和neo抗性基因。在T4DNA連接酶(Promeg公司)作用下，將上述兩種shRNA分別插入經(jīng)BamH Ⅰ和Hind Ⅲ雙酶切線性化的pGC-silencer-CRM30，構(gòu)建重組質(zhì)粒pGC-shRNA和pGC-shRNA-C。然后轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH-5 大腸桿菌，經(jīng)卡那霉素篩選擴增后，提取質(zhì)粒，應用酶切和測序鑒定。

二、細胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染

常規(guī)培養(yǎng)人胰腺癌細胞株PANC1。取對數(shù)生長期細胞，以2×105/孔接種至6孔板中。實驗分為3組：未轉(zhuǎn)染組、shRNA轉(zhuǎn)染組和shRNA-C轉(zhuǎn)染組。待細胞達到60%～80%融合后，采用LipofectamineTM2000將重組質(zhì)粒pGC-shRNA和pGC-shRNA-C轉(zhuǎn)染細胞，常規(guī)培養(yǎng)6 h后更換完全培養(yǎng)基。同時設未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的細胞作為對照組。每組均分為24、48、72 h 3個時間點。

三、細胞SIRT1 mRNA檢測

用Trizol提取轉(zhuǎn)染后細胞的總RNA。SIRT1上游引物5′- CGGAAACAATACCTCCACCTGA-3′，下游引物5′-GAAGTCTACAGCAAGGCGAGCA-3′，擴增產(chǎn)物242 bp；內(nèi)參GAPDH上游引物5′-GACAACTTTGGCATCGT-3′，下游引物5′-ATGCAGGGATGATGTTCTGG-3′，擴增產(chǎn)物133 bp。先逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后行實時熒光定量PCR。PCR反應條件：94℃ 5 min，94℃ 30 s、58℃ 30 s、72℃ 30 s，45個循環(huán)。在延伸的過程中搜集熒光信號，采用FTC-2000熒光PCR儀自帶的實時熒光定量PCR分析程序分析CT(cycle threshold)值。目的基因mRNA相對表達量=2-ΔCT，其中ΔCT=待測樣本(CT目的基因-CTβ-actin)。

四、細胞SIRT1蛋白表達檢測

制備轉(zhuǎn)染細胞的細胞爬片，4%多聚甲醛固定，常規(guī)免疫組化染色。兔抗人SIRT1多克隆抗體、辣根過氧化物酶(HRP)標記二抗購自美國Santa Cruz公司；鼠抗人Bax、Bcl-2、β-actin單克隆抗體及免疫細胞化學試劑購自武漢博士德公司。以細胞胞核內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性表達。隨機計數(shù)200個細胞，計算陽性表達細胞占總細胞數(shù)的百分率。

五、細胞增殖能力檢測

采用MTT法。96孔板中每孔接種細胞1×103(200 μl)，于轉(zhuǎn)染后12、24、48、72、96 h每孔加入0.5%MTT 25 μl，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄上清液，加入DMSO 150 μl/孔，充分振蕩10 min，酶標儀測定各孔A570值。每組每時間點設6個復孔，取均值。

六、Caspase-3和caspase-9酶活性檢測

收集轉(zhuǎn)染后24、48、72 h細胞，提取蛋白并測定蛋白濃度。按照caspase-3、caspase-9檢測試劑盒(南京凱基公司)說明書操作。每組設3個復孔，取其平均A405值。

七、細胞SIRT1、Bax、Bcl-2蛋白的表達

取轉(zhuǎn)染后48 h細胞，用細胞裂解液，抽提細胞蛋白。取40 g蛋白行Western blotting，ECL發(fā)光。以β-actin作為內(nèi)參。計算機掃描圖像，以目的蛋白與β-actin灰度值的比值表示蛋白的相對表達量。每個樣本重復檢測3次。

八、統(tǒng)計學方法

結(jié) 果

一、重組質(zhì)粒測序鑒定及細胞轉(zhuǎn)染

重組質(zhì)粒經(jīng)酶切后可見900 bp左右的DNA 片斷，經(jīng)測序表明，插入片斷序列完全正確(圖1)。重組質(zhì)粒pGC-SIRT1和pGC-SIRT1-C轉(zhuǎn)染細胞48 h后，轉(zhuǎn)染效率為50%左右。

圖1 shRNA(上) 和shRNA-C(下)的測序結(jié)果

二、細胞SIRT1 mRNA表達的變化

shRNA轉(zhuǎn)染組細胞SIRT1 mRNA表達明顯被抑制。以未轉(zhuǎn)染組為標準，轉(zhuǎn)染后24、48、72 h SIRT1 mRNA的表達抑制率分別為(68.4±12.2)%、(76.2%±10.4)%、(79.2%±6.4)%；shRNA-C轉(zhuǎn)染組的SIRT1 mRNA表達無明顯被抑制(圖2)。

注：與未轉(zhuǎn)染組比較，aPlt;0.01

三、細胞SIRT1 蛋白表達的變化

shRNA轉(zhuǎn)染組細胞SIRT1蛋白陽性表達細胞數(shù)量明顯減少。以未轉(zhuǎn)染組為1，轉(zhuǎn)染后24、48、72 h SIRT1蛋白陽性表達的抑制率分別為(69.0±9.3)%、(80.1±11.6)%、(81.0±2.0)%；shRNA-C轉(zhuǎn)染組的SIRT1陽性表達率無明顯被抑制(圖3)。

圖3未轉(zhuǎn)染組(a)、shRNA組(b)和shRNA-C組(c)細胞SIRT1蛋白陽性表達及表達量(d)

四、細胞增殖率的變化

shRNA轉(zhuǎn)染組轉(zhuǎn)染后48、72、96 h細胞增殖抑制率分別為(21.7±13.4)%、(45.1±6.5)%、(48.0±8.3)%；shRNA-C組細胞增殖率未受抑制(圖4)。

五、細胞caspase-3、caspase-9 活性的改變

shRNA 轉(zhuǎn)染組caspase-3、caspase-9活性隨時間延長逐漸升高，其中48、72 h 與未轉(zhuǎn)染組和shRNA-C組間有顯著性差異(圖4，Plt;0.05)。

六、細胞SIRT1、Bax、Bcl-2蛋白表達水平的變化

shRNA轉(zhuǎn)染組72 h點的SIRT1和Bcl-2蛋白表達量較未轉(zhuǎn)染組及shRNA-C組明顯減少，而Bax蛋白表達量明顯升高(P值均lt;0.01)；shRNA-C組與未轉(zhuǎn)染組間的蛋白表達水平無顯著性差異(圖4)。

討 論

SIRT1是煙堿腺嘌呤二核苷酸(NAD+)依賴性的去乙酰化酶，是細胞處于應激狀態(tài)時促進防御和存活的一種關鍵酶[4]。在正常組織和器官中，其活化效應表現(xiàn)為抑制細胞進入衰老狀態(tài)，并延長壽命。研究表明，SIRT1可通過去乙酰化抑制p53的轉(zhuǎn)錄活性，抑制p53介導的細胞凋亡；在突變細胞中，過量表達的SIRT1可以增強細胞對環(huán)境的應激適應能力，提示SIRT1在調(diào)控p53信號通路以及調(diào)節(jié)細胞應激反應中發(fā)揮關鍵作用[5]。也有研究者發(fā)現(xiàn)，SIRTI可通過調(diào)節(jié)細胞凋亡相關基因Bax的功能抑制凋亡的發(fā)生，Bax與DNA修復因子Ku70結(jié)合，形成復合物，只有Ku70被乙酰化，Bax才會被釋放，而SIRT1可使Ku70去乙酰化，阻止Bax轉(zhuǎn)位到線粒體，從而抑制細胞凋亡[6]。然而，在腫瘤組織中，SIRT1的活化使得腫瘤細胞在體內(nèi)抑癌因素的作用下獲得更多進行自我修復、調(diào)整和增加存活的機會，持續(xù)增值，并較少發(fā)生凋亡。在乳腺癌和結(jié)腸癌細胞中，Pruitt等[7]發(fā)現(xiàn)SIRT1抑制劑可激活抑癌基因活性；在抑癌基因HIC1(hypermethylated in cancer1)敲除鼠形成的腫瘤中，SIRT1表達活性增加，使p53活性降低，參與了腫瘤的形成[8]。

圖4 各組細胞增殖率(a)、caspase-3(b)和caspase-9(c)的活性及SIRT1、Bax、Bcl-2蛋白的表達(d)

本實驗選擇高表達SIRT1基因的胰腺癌PANC1細胞為研究對象，運用shRNA，通過真核表達載體體外轉(zhuǎn)染技術，特異性阻斷細胞SIRT1表達。結(jié)果顯示，SIRT1沉默效應在轉(zhuǎn)染后48 h最為明顯，以后基本趨于穩(wěn)定。PANC1細胞增殖被抑制。Caspase家族的激活在細胞凋亡過程中起著關鍵的作用[9]。活化的caspase-3 能裂解DNA修復相關分子、凋亡抑制蛋白、細胞外基質(zhì)蛋白及骨架蛋白等，促使細胞凋亡。本結(jié)果顯示，shRNA轉(zhuǎn)染組細胞caspase-3、caspase-9活性顯著增高，并呈一定的時間依賴性。這與Ford等[10]在結(jié)腸癌細胞系中觀察到的結(jié)果相似。我們推測，抑制細胞SIRT1基因表達后，減少了其對caspase酶的抑制作用，從而抑制細胞生長，促進細胞凋亡。同時，SIRT1轉(zhuǎn)染組細胞在轉(zhuǎn)染72 h時，Bax蛋白表達水平上調(diào)，Bcl-2蛋白表達水平下調(diào)，也說明SIRT1可通過Bax/Bcl-2途徑調(diào)節(jié)細胞的凋亡過程。

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2009-07-28)

(本文編輯：呂芳萍)

EffectsofsilencingSIRT1geneexpressiononproliferationandapoptosisofpancreaticcancercelllinePANC1

ZHAOGang,CUIJing,WANGChun-you.

DepartmentofPancreaticSurgical,Unionhospital,TongjiMedicalCollege,HuazhongUniversityofScienceandTechnology,Wuhan430022,China

WANGChun-you,Email:chunyouwang52@126.com

ObjectiveTo investigate the effects of SIRT1 gene expression inhibited by shRNA on proliferation and apoptosis of pancreatic carcinoma PANC1 cells.MethodsThe eukaryotic expression plasmid of short hairpin RNA (shRNA) targeting SIRT1 gene (SIRT1-shRNA) was constructed as pGC-shRNA and transfected into PANC1 cells. There were shRNA-control transfection group and untransfection control group. The expressions of SIRT1 mRNA and protein were detected with real-time PCR and immunocytochemistry assay, respectively. The growth rate of PANC1 cells was detected by MTT. Activity of caspase-3 and caspase-9 were detected by ELASA. Expressions of Bax, Bcl-2 proteins were determined by Western blotting.ResultsCompared with untransfected group, the inhibition rate of expressions of SIRT1 mRNA and protein were (76.2±10.4)% and (80.1±11.6)%, cytostasis rate was (45.1±6.5)%, caspase-3 and caspase-9 activity was significantly increased, Bax protein was up-regulated, while Bcl-2 protein was down-regulated 48h after transfection.ConclusionsRecombinant expression plasmid SIRT1 shRNA could significantly inhibit the expression of SIRT1 gene, and the mechanism may include increased caspase-3 and caspase-9 activity and Bax protein up-regulation, as well as Bcl-2 down-regulation.

Pancreatic neoplasms; SIRT1; Small interfering RNA; Cell proliferation; Apoptosis

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2010.02.010

國家自然基金資助項目(30600594)

430022 湖北武漢，華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬協(xié)和醫(yī)院胰腺外科

王春友，Email:chunyouwang52@126.com