香菇蛋白的分級(jí)純化和結(jié)構(gòu)分析

李 波,蘆 菲,田 燕,趙 森

河南科技學(xué)院食品學(xué)院,新鄉(xiāng) 453003

香菇蛋白的分級(jí)純化和結(jié)構(gòu)分析

李 波＊,蘆 菲,田 燕,趙 森

河南科技學(xué)院食品學(xué)院,新鄉(xiāng) 453003

香菇粉經(jīng) 10℃pH 10的水提取制備香菇蛋白,得率 13.1%,其蛋白含量 47.5%,多糖含量 24.2%。香菇蛋白經(jīng)DEAE Sepharose CL-6B柱層析分級(jí)得 5個(gè)級(jí)分,收集級(jí)分 F1、F2、F3、F4,它們都是由蛋白和多糖構(gòu)成的復(fù)合物。Sepharose CL-6B凝膠色譜顯示,F2和 F4的分子量分布較為均勻,且以蛋白為主,多糖含量很低;F3主要由兩個(gè)分子量不同的蛋白級(jí)分構(gòu)成,含有一定的多糖;F1中多糖含量較高,蛋白含量較少,且多糖分子量分布均勻。香菇蛋白的分子量主要集中在 20 kDa～40 kDa之間。F1、F3、F4都屬于酸性蛋白質(zhì),含有除色氨酸之外的 7種必需氨基酸,除蛋氨酸含量較低外,其余必需氨基酸含量接近,且賴氨酸含量較高。紅外光譜分析表明,香菇蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)主要為α-螺旋和無規(guī)卷曲。

香菇;蛋白;分級(jí);結(jié)構(gòu)

香菇 (Lentinus edodes)是我國(guó)的特色食用菌,產(chǎn)量居世界第一位。香菇富含多種營(yíng)養(yǎng)保健成分[1],目前國(guó)內(nèi)外對(duì)香菇多糖的研究報(bào)道較多[2],而對(duì)香菇中其他功能成分的研究開發(fā)很少。根據(jù)我們的分析結(jié)果,香菇干粉的蛋白含量為 21.8%(凱氏定氮法)。如果在提取香菇多糖的同時(shí),能夠?qū)⒌鞍椎裙δ艹煞忠徊⑻崛〕鰜?則能充分利用香菇原料資源,提高產(chǎn)品的附加值,促進(jìn)香菇產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展。

本文利用香菇蛋白與多糖溶解性的差異,先將蛋白提取出來,殘余物用于提取多糖。對(duì)提取出的香菇蛋白,采用離子交換和凝膠過濾柱層析進(jìn)行了分級(jí)純化,并對(duì)各級(jí)分的分子量、氨基酸組成和紅外光譜進(jìn)行了分析。

1 材料與方法

1.1 材料

鮮香菇(申香 5號(hào))購(gòu)自新鄉(xiāng)市李莊村香菇生產(chǎn)基地,經(jīng)干燥、粉碎后備用。

Agilent 1100氨基酸自動(dòng)分析儀,Bruker TENSOR-27傅立葉變換紅外光譜儀,尤尼柯 7200可見分光光度計(jì)。柱層析系統(tǒng)(梯度混合儀、恒流泵、紫外檢測(cè)器、自動(dòng)收集器、記錄儀)為上海滬西分析儀器廠產(chǎn)品。DEAE Sepharose CL-6B和 Sepharose CL-6B(GE Healthcare Bio-Sciences AB公司)。透析袋(8000～12000,寶信生物科技有限公司)。所用試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 香菇蛋白的提取

取 100 g香菇粉,加 pH 10的水 1000 mL,在 10℃提取 30 min,離心分離 (3000 r/min,15 min),收集上清液(沉淀可用于提取香菇多糖)。上清液減壓濃縮后,加乙醇至 83%乙醇濃度,4℃放置過夜。離心分離,沉淀依次用乙醇、丙酮洗滌沉淀后,于40℃烘干,得香菇蛋白。

1.2.2 香菇蛋白的分級(jí)純化

取 0.5 g香菇蛋白,用50 mL磷酸鹽緩沖液(pH 7,0.02 mol/L)溶解后,離心 (4000 r/min,20 min),取上清液,經(jīng) DEAE Sepharose CL-6B柱 (2.6×20 cm)層析,用磷酸鹽緩沖液 (pH 7,0.02 mol/L)洗脫出第一個(gè)級(jí)分后,進(jìn)行 0.2～1.0 mol/L NaCl-磷酸緩沖液 400 mL線性梯度洗脫,最后用 2 mol/L NaCl-磷酸緩沖液 200 mL進(jìn)行洗脫。洗脫液流速為1 mL/min,每管收集 9 mL。以苯酚-硫酸法檢測(cè)多糖 (490 nm)[3],紫外 280 nm檢測(cè)蛋白。

洗脫液透析脫鹽濃縮后,冷凍干燥,得離子交換各級(jí)分。各級(jí)分用磷酸鹽緩沖液溶解后,經(jīng) Sepharose CL-6B柱 (1.6×100 cm)層析,用 0.1 mol/L的NaCl-磷酸緩沖液 (pH 7,0.02 mol/L)洗脫。洗脫液流速為 15 mL/h,每管收集 4 mL。

1.2.3 分子量測(cè)定

Sepharose CL-6B柱(1.6×100cm)層析方法,用已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白制作標(biāo)準(zhǔn)曲線,0.1 mol/L的NaCl-磷酸緩沖液(pH 7,0.02 mol/L)洗脫。

1.2.4 氨基酸組成分析

樣品經(jīng) 6 mol/L鹽酸在 110℃水解 24 h,用氨基酸自動(dòng)分析儀測(cè)定。

1.2.5 紅外光譜分析

采用KBr壓片法。

1.2.6 蛋白含量測(cè)定

香菇蛋白中的蛋白質(zhì)含量測(cè)定采用凱氏定氮法。

2 結(jié)果與討論

2.1 香菇蛋白的提取

100 g香菇粉經(jīng)提取制備,可得香菇蛋白 13.1 g,其蛋白含量為 47.5%,多糖含量為 24.2%。同時(shí),可得到香菇多糖 5.6 g,其多糖含量為 69.5%,蛋白含量為 18.3%。

2.2 香菇蛋白的分級(jí)純化

香菇蛋白溶解后,用陰離子交換色譜 DEAE Sepharose CL-6B進(jìn)行分級(jí)。樣品經(jīng)磷酸鹽緩沖液洗脫出級(jí)分 F1,然后經(jīng) 0.2～1.0 mol/L NaCl線性梯度洗脫出級(jí)分 F2、F3、F4,最后經(jīng) 2 mol/L NaCl洗脫出級(jí)分 F5(圖 1)。由于 F5含量很少,所以僅收集了 F1、F2、F3、F4這四個(gè)級(jí)分。由圖可看出,在蛋白出峰的位置也存在多糖的峰,表明這四個(gè)級(jí)分的蛋白和多糖是以結(jié)合形式存在的,這可能也是香菇蛋白中含有 24%多糖的原因之一。F1多糖含量較高,F4蛋白含量較高。

圖 1 香菇蛋白的DEAE Sepharose CL-6B柱層析Fig.1 Chromatogram of PLE on a DEAE Sepharose CL-6B column

圖 2 級(jí)分 F1～F4的 Sepharose CL-6B柱層析Fig.2 Chromatogram of fractions F1-F4 on a Sepharose CL-6B column

凝膠過濾色譜可根據(jù)蛋白分子的大小和形狀不同而將其進(jìn)行分離。級(jí)分 F1-F4的 Sepharose CL-6B柱色譜(圖 2)顯示,F4和 F2的分子量分布較為均勻,且以蛋白為主,多糖含量很低;F3主要由兩個(gè)分子量不同的蛋白級(jí)分構(gòu)成,含有一定的多糖;F1中多糖含量很高,而蛋白含量較少,且多糖分子量分布均勻。

2.3 不同級(jí)分的分子量

經(jīng) Sepharose CL-6B凝膠柱層析測(cè)定,F1的分子量為 26515 Da,F2為 22683 Da,F3為 42355和322329 Da,F4為 30996 Da。結(jié)果顯示,香菇蛋白的分子量主要集中在 20～40 kDa之間,另有 1級(jí)分分子量較大,超過 300 kDa。

2.4 不同級(jí)分的氨基酸組成

表 1顯示,三種級(jí)分中天冬氨酸和谷氨酸含量較高,它們屬于酸性氨基酸。二者之和與賴氨酸、精氨酸、組氨酸 (均為堿性氨基酸)之和的比值分別為:F1=1.664,F3=2.587,F4=3.474。因此,三種級(jí)分都屬于酸性蛋白質(zhì),且在pH 7時(shí)蛋白質(zhì)所帶負(fù)電荷的大小為 F4>F3>F1,所以在陰離子交換柱層析時(shí) F1最先被洗脫出來,F4最后被洗脫出來。三種級(jí)分中絲氨酸和蘇氨酸含量較高,二者易與糖鏈形成O-糖苷鍵的連接,這可能是香菇蛋白中結(jié)合有較多糖鏈的一個(gè)原因。三種級(jí)分含有除色氨酸之外的 7種必需氨基酸,除蛋氨酸含量較低外,其余必需氨基酸含量接近,且賴氨酸含量較高,而賴氨酸是大米、小麥等谷物食品的第一限制氨基酸。因此香菇蛋白對(duì)平衡膳食中的氨基酸比例具有重要意義。

2.5 不同級(jí)分的紅外光譜

蛋白質(zhì)在紅外區(qū)有若干特征吸收帶,其中酰胺I帶 (1600～1700 cm-1)的譜峰指認(rèn)目前比較成熟, 1650～1658 cm-1為α-螺旋,1610～1640 cm-1為β-折疊,1660～1700 cm-1為β-轉(zhuǎn)角,1640～1650 cm-1為無規(guī)卷曲[4,5]。香菇蛋白的紅外光譜 (圖 3)在酰胺I帶呈現(xiàn)很強(qiáng)的吸收峰,各級(jí)分在酰胺 I帶的譜峰為:F1—1656、1648、1642 cm-1;F2—1657、1649、1641 cm-1;F3—1650 cm-1;F4—1659、1653、1647 cm-1。據(jù)此分析,F1的二級(jí)結(jié)構(gòu)為α-螺旋和無規(guī)卷曲,且后者比例稍多;F2與 F1類似;F3只有一個(gè) 1650 cm-1峰,恰恰位于α-螺旋與無規(guī)卷曲的交界處,暗示 F3的二級(jí)結(jié)構(gòu)可能比較均一;F4也存在α-螺旋和無規(guī)卷曲,且前者比例稍多。

表 1 級(jí)分 F1、F3、F4的氨基酸組成Table 1 Amino acid composition of F1,F3 and F4

圖 3 香菇蛋白各級(jí)分的紅外光譜Fig.3 I R spectra of PLE fractions

3 結(jié)論

100 g香菇粉經(jīng) 10℃pH 10的水提取,可得香菇蛋白 13.1 g,其蛋白含量為 47.5%,多糖含量為24.2%。香菇蛋白經(jīng) DEAE Sepharose CL-6B柱層析分級(jí),可得 5個(gè)級(jí)分。收集級(jí)分 F1、F2、F3、F4,它們都是由蛋白和多糖構(gòu)成的復(fù)合物,蛋白和多糖之間存在較強(qiáng)的結(jié)合作用力。

Sepharose CL-6B凝膠色譜顯示,F4和 F2的分子量分布較為均勻,且以蛋白為主,多糖含量很低; F3主要由兩個(gè)分子量不同的蛋白級(jí)分構(gòu)成,含有一定的多糖;F1中多糖含量較高,蛋白含量較少,且多糖分子量分布均勻。香菇蛋白的分子量主要集中在20～40 kDa之間,另有 1級(jí)分分子量較大,超過 300 kDa。

級(jí)分 F1、F3、F4都屬于酸性蛋白質(zhì),天冬氨酸和谷氨酸含量較高。三種級(jí)分含有除色氨酸之外的7種必需氨基酸,除蛋氨酸含量較低外,其余必需氨基酸含量接近,且賴氨酸含量較高。紅外光譜分析表明,香菇蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)主要為α-螺旋和無規(guī)卷曲。

1 Zhang RG(張潤(rùn)光),Su DH(蘇東華),Zhang XC(張小翠).Nutritional functions and products developmentofLentinus edodes.Food Res Dev(食品研究與開發(fā)),2004(4): 125-128.

2 Luo W(羅煒),Li D(李東).Research advances inLentinan.Food Fer men Indus(食品與發(fā)酵工業(yè)),2000,26(4): 63-67.

3 ZhangWJ(張惟杰).Biochemistry Technology of Glycoconjugates(糖復(fù)合物生化研究技術(shù)).Hangzhou:Zhejiang U-niversity Press,1999.11-12.

4 Ge ZC(戈志成),Zhang YP(張燕萍).Studying the secondary structure ofmodified gluten by FTIR.J Chin Cereals and O ils Association(中國(guó)糧油學(xué)報(bào)),2006,21(3):36-38.

5 Zhou W(周文),Chen X(陳新),Shao ZZ(邵正中).Conformation studies of silk proteins with infrared and raman spectroscopy.Progress in Chem(化學(xué)進(jìn)展),2006,18:1514-1522.

Fractionation and Structure of Protein fromLentinus edodes

L IBo＊,LU Fei,T IAN Yan,ZHAO Sen
School of Food Science,Henan Institute of Science and Technology,Xinxiang 453003,China

Powder ofLentinus edodeswas treated with water of 10℃and pH 10 to extract the protein ofLentinus edodes (PLE).The yield of PLE was 13.1%,and its protein contentwas 47.5%and polysaccharide contentwas 24.2%.PLE was graded into five fractions by chromatography on a DEAE Sepharose CL-6B Column.Fractions F1,F2,F3 and F4 were collected,which allwere the complex of protein and polysaccharide.Gel filtration chromatography of Sepharose CL-6B showed thatmolecularweight(Mw)distribution of F2 and F4 was symmetrical,and they contained mainly protein and little polysaccharide.F3 was composed of two protein fractions with differentMw and contained some polysaccharide.F1 contained more polysaccharide and less protein and itsMw distribution was symmetrical.Mw of PLE wasmainly between 20-40 kDa.F1,F2 and F3 were belonged to acidic proteins.They contained seven kindsof essential amino acids except Trp.Besides ofMetwith less content,other amino acids had a lmost content and the contentofLyswas higher.I R spectra showed that secondary structure of PLE mainlywasα-helix and random coil.

Lentinus edodes;protein;fractionation;structure

1001-6880(2010)02-0257-04

2008-07-23 接受日期:2008-10-14

河南省高校新世紀(jì)優(yōu)秀人才支持計(jì)劃項(xiàng)目(2006HANCET-17);河南科技學(xué)院重點(diǎn)科研項(xiàng)目

＊通訊作者 Tel:86-373-3040977;E-mail:libowuxi@yahoo.com.cn

Q946.1;R284.1

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