鹿茸血肽疏水性分離及抗氧化和ACE抑制作用的研究

任建東,施用暉1,,樂國偉1,＊,馬立芹,尹曉平,姜 紅

1江南大學食品科學與技術國家重點實驗室;2江南大學食品學院營養與食品安全研究所,無錫 214122

鹿茸血肽疏水性分離及抗氧化和ACE抑制作用的研究

任建東2,施用暉1,2,樂國偉1,2＊,馬立芹2,尹曉平2,姜 紅2

1江南大學食品科學與技術國家重點實驗室;2江南大學食品學院營養與食品安全研究所,無錫 214122

實驗采用DA201-C型大孔吸附樹脂對 Alcalase蛋白酶水解鹿茸血 3 h的水解液進行吸附,采用 25%、50%、75%、100%乙醇分級洗脫,收集各組分進行氨基酸組成分析,發現各洗脫組分具有不同疏水性值,同時測定各組分的血管緊張素轉化酶(ACE)抑制活性和二苯代苦味肼基自由基 (DPPH·)清除活性:75%乙醇洗脫組分的ACE抑制活性最高,為 54.71%,且ACE抑制活性與組分疏水性值顯著相關;100%乙醇洗脫組分的 DPPH ˙清除率最高。

鹿茸血;大孔吸附樹脂;疏水性;ACE抑制活性;DPPH自由基

大孔樹脂分離純化技術是 20世紀 60年代末發展起來的一類新型非離子型高分子吸附劑,具有分離條件溫和、設備簡單、操作方便、容易再生等特點,已廣泛應用于環保、化工、醫藥等行業。關于大孔吸附樹脂用于制藥及天然植物中活性成分如皂苷、黃酮、內脂、生物堿等大分子化合物的提取分離已有大量報道[1],而近年來程云輝[2]、鐘芳[3]、過振宇[4]、Cheison[5]等利用大孔吸附樹脂分級純化大豆肽、麥胚肽、家蠅抗菌肽、乳清蛋白水解物,得到不同生物活性的組分,將大孔吸附樹脂的應用拓展到新的領域。

大孔吸附樹脂主要通過分子間作用力如范德華力或氫鍵等對溶液中的分子進行吸附,吸附劑表面的親水性或者疏水性決定了其具有不同的吸附特性;同時本身的多孔性結構亦決定了其具有一定的分子篩作用。因此根據大孔樹脂的極性、孔徑等吸附特性,配合不同極性的洗脫劑洗脫,可以分離純化得到不同極性,即不同疏水性的組分[2-5],這對于生物活性肽的分離制備具有重要意義,因為目前已知大部分多肽的生物活性均與疏水性氨基酸密切相關[5]。因此,本實驗采用具有多種生物活性的鹿茸血[7]酶解物經DA201-C型大孔吸附樹脂,以乙醇為洗脫劑進行梯度洗脫,計算各組分疏水性值并研究其與抗氧化和ACE抑制活性的關系。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

鹿茸血 (新疆特豐藥業集團);Alcalase FG 2.4L (Novo公司);DA201-C型大孔吸附樹脂 (江蘇蘇青水處理工程集團有限公司);ACE(sigma公司); Multiskan MK3酶標儀 (美國 Thermo公司);Agilent1100型氨基酸自動分析儀(美國安捷倫公司)。

1.2 鹿茸血肽的制備

在鹿茸血中加入適量蒸餾水,配制成 50 mg/mL底物,于沸水浴加熱 10 min,冷卻至 60℃,用 2 mol/ L NaOH溶液調節 pH值等于 9.0,按照 30μL/g底物蛋白的比例加入 Alcalase蛋白酶酶液進行反應, Alcalase蛋白酶活力為 1.10×104U/mL。不斷滴加2 mol/L NaOH溶液維持 pH值穩定。水解過程在酶解器中進行,保持溫度穩定在 60℃。3 h后停止反應,沸水浴 10 min后迅速冷卻滅酶,4000 rpm離心20 min取上清液備用。最終水解度為 13.80%。

1.3 DA201-C大孔樹脂分級洗脫上樣濃度和流速的確定

將一定量的樹脂用無水乙醇浸泡 24 h,然后用無水乙醇洗至 220 nm無吸收峰,再用去離子水洗凈,裝滿 2.6 cm×30 cm的層析柱。

不同流速對 DA201-C大孔樹脂吸附性能的影響:室溫條件下,用濃度為 10 mg/mL的水解液以0.5、1、2 BV/h的速度流經層析柱,用紫外檢測器檢測流出液的A220 nm,以A220 nm=0.05為穿透點,比較不同流速時的穿透體積。

不同濃度對DA201-C大孔樹脂吸附性能的影響:用濃度為 10、30、50 mg/mL的水解液以 0.5 BV/ h的速度流經層析柱,用紫外檢測器檢測流出液的A220 nm,以A220 nm=0.05為穿透點,比較不同流速時的穿透體積。

1.4 鹿茸血肽的大孔吸附樹脂動態乙醇分級洗脫

室溫條件下,用濃度為 50 mg/mL的鹿茸血肽以0.5 BV/h的流速流經層析柱,用紫外檢測器檢測流出液的A220 nm,以A220 nm=0.05為穿透點,停止上樣。用去離子水洗去未吸附的物質,之后分別用25%、50%、75%、100%的乙醇以 2 BV/h的流速流經層析柱,當 A220 nm吸光值小于 0.05的時候停止洗脫。收集各洗脫峰。旋轉蒸發后冷凍干燥,測定各組分的ACE抑制活性及DPPH·清除活性。

1.5 DPPH·清除活性的測定

取樣品 0.4 mL,加入 1×10-4mol/L DPPH·無水乙醇 2.8 mL混勻,避光反應 20 min,4000 rpm離心 10 min,取上清夜在 517 nm測吸光度,樣品的吸光度為Ai;空白組用等體積的無水乙醇代替 DPPH ·無水乙醇溶液,吸光度為 Aj;對照組用等體積的蒸餾水代替樣品,吸光度為Ao。

1.6 ACE抑制率的測定

采用 Guang-Hong L等[8]人的馬尿酸直接比色法。

1.7 氨基酸組成分析

氨基酸自動分析儀法,按照國家標準進行測定。

1.8 蛋白質或多肽疏水值的計算[9]

式中:AAi為 100 g蛋白質中各種氨基酸的含量(g);M i為各種氨基酸的摩爾質量 (g/mol);ΣAAi/ M i為 100 g蛋白質中氨基酸的總摩爾數 (mol);Δfti為氨基酸側鏈疏水性值 (kJ/mol);ΔQ為蛋白質的疏水性值。

1.9 統計分析

將分級洗脫各組分的疏水性值,抗氧化和ACE抑制活性輸入 SPSS10.0軟件,分別對疏水性值與DPPH·清除率,以及疏水性值與 ACE抑制率進行相關性分析。

2 結果與討論

2.1 DA201-C大孔樹脂分級洗脫上樣濃度和流速的確定

本實驗采用的 DA201-C型大孔吸附樹脂是一種比表面積較大的非極性吸附樹脂,在多肽的分離中應用較為廣泛[2-4,9]。實驗首先討論了上樣流速和濃度對樹脂吸附量的影響,結果見表 1和 2。

表 1 不同流速的穿透點通液量Table 1 Volume of brokethrough point at different flow rates

表 2 不同濃度的穿透點通量Table 2 Volume of brokethrough point at different concentrations

對同一濃度的上樣溶液,若吸附流速過大,被吸附物質來不及擴散到樹脂的內表面就提早泄露,而造成樣品的流失,樹脂的吸附量就會下降;但吸附流速過小,吸附時間就會延長。確定最佳的吸附流速通常應綜合考慮樹脂的吸附效果和工作效率。由表1可看出,隨著上樣流速由 0.5 BV/h提高到 2 BV/ h,通液量明顯降低,樹脂的吸附量也會隨之降低,故本試驗確定 0.5 BV/h為上樣流速。表 2結果顯示,大孔吸附樹脂的穿透點通液量隨著被吸附物的濃度提高而增大,在不超過大孔樹脂吸附容量的情況下,可以適當提高上樣濃度來增大動態吸附量。本試驗中,選擇 50 mg/mL濃度上樣。

2.2 DA201-C大孔吸附樹脂分級洗脫及活性測定

蛋白的酶解使得原先埋藏在蛋白質分子內部的疏水性氨基酸暴露出來,從而使酶解得到的多肽可以從水相通過疏水相互作用吸附到樹脂的疏水表面。不同濃度的乙醇疏水性不同,與不同疏水性的肽段親和力也就不同,因此可利用不同極性的洗脫劑對多肽按照疏水性進行分級純化,這對生物活性肽的分離制備具有重要意義,因為已知大部分生物活性肽的活性都與疏水性氨基酸有關。如對于ACE抑制肽,疏水性氨基酸殘基占 60%以上,且 C末端的氨基酸為芳香族或疏水性氨基酸殘基的多肽具有更強的抑制活性[11]。程云輝[2]用 DA201-C型大孔樹脂對麥胚肽進行分級洗脫,鐘芳[3]用DA201-C型大孔樹脂對大豆肽進行分級洗脫,均得到不同疏水性和不同生物活性的肽段。

本實驗在濃度 50 mg/mL、0.5 BV/h條件下上樣,用水洗去未吸附的物質,后依次采用 25%、50%、75%和 100%的乙醇作為洗脫劑,對鹿茸血肽進行分級洗脫,分別收集各組分并測其得率,結果見表3。

表 3 不同濃度乙醇洗脫組分的得率Table 3 Percentages of different concentrations of ethanol delute fractions

從表 3中數據可以看出,大部分多肽在 25%和50%的乙醇濃度下被洗脫,這說明大孔樹脂和鹿茸血肽之間的疏水性吸附較弱,很容易便被低濃度的乙醇洗脫下來。隨著乙醇濃度增大,被洗脫的多肽含量顯著下降。實驗對不同濃度乙醇洗脫組分進行了氨基酸組成分析,并計算了各組分的疏水性值,結果見表4。

表 4 水解液及梯度洗脫各組分的氨基酸組成 (g/100 g蛋白)Table 4 Amino acid compositions of hydrolysate and ethanol delute fractions(g/100 g protein)

注:未包含色氨酸含量,氨基酸側鏈疏水值來源于文獻[9]Note:The contentwithout tryptophan,the value of hydrophobicity refer to reference 9

由表 4分析結果可知,隨著洗脫劑濃度提高,洗脫組分的疏水值也在升高,75%乙醇洗脫組分具有最高的疏水值為 5.63 kJ/mol、100%乙醇洗脫組分的疏水值雖稍有降低,但相對于乙醇濃度較低的幾個組分,仍保持在一個較高水平上。與未分離的鹿茸血肽相比,側鏈疏水值 10以上的氨基酸含量均有明顯提高。

按照設想,100%乙醇疏水性最強,其洗脫組分應具有最高的疏水值,但實際 100%乙醇洗脫得到的組分疏水值為 5.59 kJ/mol,略低于 75%乙醇洗脫組分的疏水值。其原因可能為某些疏水性多肽在無水乙醇中的溶解性降低,以致其疏水值降低。實驗發現[2],75%乙醇解吸效果好于 95%乙醇,這說明某些肽段無法溶解于高濃度的乙醇,其疏水值有可能降低。

本實驗進一步考察了各洗脫組分的ACE抑制活性,抗氧化活性及其與肽段疏水性的關系。各洗脫組分的ACE抑制活性和DPPH·清除活性測定結果見圖 1、2(測定活性時樣品濃度均為 0.2 mg/ mL),疏水性值與ACE抑制活性和抗氧化活性的相關性分析結果見表 5。由圖 1、2和表 5結果可知,相對于分離前的水解液,各組分ACE抑制活性和抗氧化活性均有較大提高;ACE抑制活性與肽段疏水性值存在顯著相關性,ACE抑制率隨著肽段疏水性的升高而升高,75%乙醇洗脫得到的肽段具有最高的ACE抑制率,為 54.71%,但 100%乙醇洗脫組分的ACE抑制活性卻稍有降低,這與鐘芳[3]的研究結果一致;而肽段疏水性值與DPPH˙清除率之間并無顯著相關,DPPH˙清除率隨洗脫劑濃度的升高而一直升高,100%乙醇洗脫組分具有最高清除率,為9.84%。

表 5 疏水性值與ACE抑制活性和抗氧化活性的關系Table 5 The relationship between hydrophobicity and ACE inhibitory activity and antioxidative activity

3 結論

綜上所述,實驗采用DA201-C型大孔吸附樹脂對鹿茸血肽進行分級洗脫,氨基酸組成和疏水性值計算結果說明大孔樹脂可按疏水性不同對蛋白或多肽進行分離。同時測定 ACE抑制活性和抗氧化活性,結果顯示各組分疏水性值與ACE抑制活性顯著相關。大孔吸附樹脂可作為對生物活性肽進行初步分離的簡單有效手段。

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Study on the Hydrophobic Separation,ACE Inhibitory Activity and Antioxidative Activity of Red Deer Antler Blood Hydrolysate Peptides

REN Jian-dong2,SH I Yong-hui1,2,LE Guo-wei1,2＊,MA Li-qin2,Y IN Xiao-ping2,J IANG Hong21State Key Laboratory of Food Science and Technology,Jiangnan University;2Institute of Nutrition and Food Safety,School of Food Science and Technology,Jiangnan University,W uxi 214122,China

Red deer antler blood hydrolysateswere prepared by enzymatic hydrolysiswith Alcalase for 3 h.Macroporous adsorption resin were used for the fractionation of hydrophobic peptides from the hydrolysates by gradient ethanol elution.Amino acid analysis results suggested that different ethanol elution fractions have different hydrophobicities.75% ethanol fraction showed the highest inhibitory activityof angiotensin I-converting enzyme(ACE),and theACE inhibitory activity has a significant correlation with hydrophobicity.While 100%ethanol delute fraction has the highest DPPH· clearance rate.

red deer antler blood;macroporous adsorption resin;hydrophobic;ACE inhibitory activity;DPPH·

1001-6880(2010)02-0302-05

2008-03-31 接受日期:2008-08-01

國家自然科學基金項目(30571347);863項目(2007AA10Z325)

＊通訊作者 Tel:86-510-85917789;E-mail:lgw@jiangnan.edu.cn

Q516;S825

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