杜香不同提取部位的鎮痛抗炎作用研究

張 敏,趙旌旌,武文斌,趙 赟,朱興磊,瞿偉菁

華東師范大學生命科學學院,上海 200062

杜香不同提取部位的鎮痛抗炎作用研究

張 敏,趙旌旌,武文斌,趙 赟,朱興磊,瞿偉菁＊

華東師范大學生命科學學院,上海 200062

采用小鼠醋酸扭體法和角叉菜膠致小鼠足掌腫脹模型篩選杜香三種提取部位鎮痛抗炎作用。結果顯示,甲醇提取物 (10.0、1.0 mg/kg)和水提物 (10.0 mg/kg)能顯著抑制醋酸引起的小鼠扭體反應和角叉菜膠引起的小鼠足趾水腫。水提物 (10.0 mg/kg)在致炎后 2～4 h內效果接近吲哚美辛。高效液相色譜結果提示甲醇提取物的鎮痛抗炎效果可能通過其所含黃酮類化合物實現。

杜香;提取;鎮痛;抗炎;黃酮

杜香 (Ledum palustreL.)系杜鵑花科杜香屬植物[1]。我國野生杜香資源豐富,主要分布在中國東北的長白山和大小興安嶺等地區,為我國北方蒙古族和朝鮮族傳統民藥,別名白山苔、喇叭茶[2,3]。枝、葉入藥[2],主治“活血調經;化痰止咳[4]。”杜香揮發油具有明顯的鎮咳、祛痰作用[3]。杜香嫩枝煎劑具有解痛、祛痰、脫敏等作用[5]。而杜香甲醇提取物功效未見報道,本實驗通過醋酸誘導小鼠扭體反應模型和角叉菜膠誘導小鼠足趾腫脹模型比較杜香不同提取部位的急性鎮痛、抗炎作用。同時,通過高效液相色譜法探討杜香甲醇提取物有效成分及其鎮痛抗炎機制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料

杜香 (Ledum palustreL.),采自吉林省安圖縣(吉林省白河林業局提供),經本單位植物分類學研究室李宏慶副教授鑒定。

1.1.2 藥品

吲哚美辛(上海新帕斯制藥有限公司);λ-角叉菜膠 (λ-carrageenan,Sigma Co.);蘆丁 (rutin,上海恒信化學試劑公司);槲皮素(quercetin,上海恒信化學試劑公司);楊梅素 (myricetin,Sigma Co.);山柰酚(kaemferol,Sigma Co.);異鼠李素 (isorhamnetin,中國藥品生物制品檢定所);甲醇:色譜純;其他試劑均為分析純。

1.1.3 動物

實驗 ICR小鼠體重 20～22 g(上海西普爾-必凱實驗動物有限公司,滬動合證字 153號)。

1.1.4 儀器

高效液相色譜儀 (Agilent 1100 series);Kromasil C18液相色譜柱 (250×4.6 mm,5μm);電子天平(SartoriusBP-211D);游標卡尺 (精度 0.02 mm)。

1.2 方法

1.2.1 杜香各化學部位提取

杜香枝葉采摘后置于陰涼處風干,200 g材料粉碎為粗粉,水蒸氣法蒸餾 4 h后收集精油;回收杜香材料,常溫下揮干,石油醚 70℃脫脂 2次,每次 2 h;脫脂后材料常溫下揮干,分別用 1 L甲醇 70℃回流提取 3次,每次 2 h,合并提取液;再次將材料于常溫下揮干,分別用 1 L蒸餾水 95℃回流提取 3次,每次 2 h,合并提取液。抽真空濃縮,將提取物冷凍干燥,-4℃低溫密封保存備用。

1.2.2 杜香提取物對醋酸誘發的小鼠扭體反應的影響

參照 Koster法[6],略作改動:取健康小鼠 96只,雌雄各半,體重 20～25 g,隨機分成 8組,每組 12只,實驗前 12 h禁食。腹腔注射 (i.p.)待測藥物(精油 0.02,0.01 mg/kg;甲醇提取物 10.0,1.0 mg/ kg;水提物 10.0,1.0 mg/kg;v/v,10mL/kg體重);注射生理鹽水組作為空白對照;吲哚美辛組作為陽性對照藥。30 min后腹腔注射 0.6%醋酸 (v/v,10 mL/kg體重),觀察給藥后 20 min內小鼠扭體次數,并計算抑制率,抑制率 (%)=(生理鹽水組平均扭體次數 -給藥組平均扭體次數)/生理鹽水組平均扭體次數 ×100%。

1.2.3 杜香提取物對λ-角叉菜膠引起小鼠足趾腫脹的影響

參照W inter法[7],并略作改動:取健康雄性小鼠 96只,體重 20～25 g,隨機分為 8組,每組 12只,實驗前 24 h禁食。腹腔注射待測藥物 (精油 0.02, 0.01 mg/kg;甲醇提取物 10.0,1.0 mg/kg;水提物10.0,1.0 mg/kg;v/v,10 mL/kg體重);注射生理鹽水組作為空白對照;吲哚美辛組作為陽性對照藥[8]。30 min后從小鼠右后足掌心向踝關節方向進針皮下注射 1%λ-角叉菜膠 (生理鹽水溶解)50 μL,其后分別用游標卡尺測量 1、2、3、4、5、6 h后小鼠足掌心至足背厚度。以致炎后不同時間的足掌厚度減去給藥前足掌厚度之差作為炎性腫脹度。

1.2.4 統計分析

數據以“mean±S.D.”表示,用 SPSS軟件進行方差分析(One-WayANOVA)。

1.2.5 高效液相色譜法對杜香甲醇提取物定性分析

色譜條件:流動相,甲醇/0.4%磷酸溶液 (60∶40),流速 1.0 mL/min,柱溫 20℃,進樣體積 20μL,檢測波長 368 nm。樣品液制備:用色譜純甲醇溶解甲醇提取物冷凍干粉配成 2%溶液,溶液用濾紙過濾,上柱前 10000轉離心 10 min。

2 結果

2.1 杜香提取物對醋酸誘發的小鼠扭體反應的影響

表 1結果表明:10.0 mg/kg杜香甲醇提取物, 10.0 mg/kg水提物及吲哚美辛均能極顯著 (P< 0.01)地減少醋酸腹腔注射所致小鼠扭體次數,抑制率分別為 29.30%、53.50%及 72.5%。所有提取物中,10.0 mg/kg水提物止痛效果最佳,但不如陽性對照藥吲哚美辛,與之相比有顯著差異(P<0.01)。

表 1 杜香提取物對醋酸誘發小鼠扭體反應的鎮痛效果Table 1 Analagesic effect of the extracts of leaves ofLedum palustreon acetic acid-induced writhing response in mice

2.2 杜香提取物對λ-角叉菜膠引起小鼠足趾腫脹的影響

表 2結果顯示:10.0、1.0 mg/kg杜香甲醇提取物,10.0 mg/kg水提物在λ-角叉菜膠注射后 2～6 h內,均能極顯著地 (P<0.01)抑制小鼠足趾腫脹。其中以 10.0 mg/kg水提物效果最強,在致炎后2～4 h內,效果近似于吲哚美辛(與吲哚美辛組比較,P> 0.05)。1.0 mg/kg水提物在致炎后 3～6 h內能極顯著地 (P<0.01)抑制小鼠足趾腫脹。此外,0.02 mg/kg精油在致炎后 3 h時,0.01 mg/kg精油在致炎后 3～4 h內也有一定的消腫作用 (P<0.05),但效果不持續。

表 2 杜香提取物對λ-角叉菜膠引起小鼠足趾腫脹的影響Table 2 Effect of the extracts of leaves ofLedum palustreon hind paw edema induced byλ– carrageenan in mice

2.3 高效液相色譜法對杜香甲醇提取物定性分析

結果如圖 1A所示:檢測波長 368 nm下,5種黃酮標準品保留時間 (min)分別為:蘆丁 3.480、楊梅素 4.634、槲皮素 7.005、山柰酚 11.269和異鼠李素12.106。

圖 1 高效液相色譜法對杜香甲醇提取物定性分析Fig.1 Quality analysisofmethanol extractsofLedum palustre by high performance liquid chromatography

圖 1B顯示:杜香甲醇提取物在同樣條件下,在保留時間為 3.605,4.718,7.002和 12.201 min處有吸收峰存在,且添加標準品溶液后,顯示上述四個吸收峰與標準品吸收峰有疊加(如圖 C所示),判斷樣品中存在蘆丁、楊梅素、槲皮素和山柰酚 4種黃酮。

用同樣方法將杜香水提物與標準品 HPLC色譜圖比對,并在杜香水提物中添加標準品溶液后,獲得一個疊加峰,推測杜香水提物中可能含有槲皮素。

3 討論

藥用植物中黃酮類和萜類化合物的鎮痛、抗炎作用引人關注[9,10],其效果通過抑制炎癥過程中多種關鍵酶的活性實現[11],并與非甾醇類抗炎藥物(non-steroidal anti-inflammatory drugs,NSA IDs)靶點類似。

杜香精油的主要組分是萜類化合物[3],具一定毒性[2],10.0,1.0 mg/kg精油 (i.p.)在實驗中發現致死現象(結果未顯示)。0.02、0.01 mg/kg杜香精油 (i.p.)為安全劑量,但對小鼠扭體和小鼠足趾腫脹均無明顯藥效。杜香甲醇提取物能極顯著地抑制小鼠扭體反應以及小鼠足趾水腫,其中黃酮類化合物含量達 29.3% ±8.5%(分光光度法測定[12],結果未顯示)。高效液相色譜結果顯示:杜香甲醇提取物中存在蘆丁、楊梅素、槲皮素和山柰酚 4種黃酮。這四種黃酮單體均見報道具有一定的鎮痛、抗炎作用[11,13,14],提示:黃酮類化合物可能是杜香甲醇提取物鎮痛、抗炎的藥效部位。而通過標準品比對,推斷杜香水提物中可能存在槲皮素。其他有效成分有待進一步鑒定。

本實驗采用的醋酸誘導的小鼠扭體反應是一種內臟性疼痛模型[6],由 COX釋放花生四烯酸和前列腺素致痛[15]。陽性對照藥吲哚美辛具有抑制 COX活性,減少前列腺素生成的作用[16]。杜香甲醇提取物、水提物鎮痛效果不及吲哚美辛,其作用靶點和作用量效關系尚待深入研究。

角叉菜膠誘導小鼠足趾腫脹實驗是常用的急性炎癥模型。角叉菜膠注射會激發肝臟組織內自由基積累、血管舒緩激肽 (bradykinin)釋放[17]以及血清COX含量增加[18]等多條途徑,促使前列腺素合成,前列腺素和其他內分泌物積累是導致炎癥水腫的主要原因[19]。非甾醇類抗炎藥吲哚美辛對角叉菜膠誘導的水腫藥效顯著[20]。在本實驗中,杜香甲醇提取物和水提物均能顯著地抑制局部水腫,且作用效果持久,致炎后 2～6 h內與對照組比較均有極顯著差異。1 mg/kg甲醇提取物在致炎后 3 h,10 mg/kg水提物在致炎后 2～4 h內抑制效果接近吲哚美辛。

綜合以上結果,杜香甲醇提取物具有一定的鎮痛、抗炎效果。黃酮類化合物可能是杜香鎮痛、抗炎的主要藥效部位。而其效果是通過抑制 COX,還是影響前列腺素生成的其他環節,則有待于進一步研究。

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Analgesic and Anti-inflammatory Activities of Extracts fromLedum palustreL.in M ice

ZHANGMin,ZHAO Jing-jing,WU Wen-bin,ZHAO Yun,ZHU Xing-lei,QU Wei-jing＊
School of Life Science,East China Nor m al University,Shanghai 200062,China

In the present study,we have investigated the analgesic effect of the essential oil,methanol extract and aqueous extract ofLedum palustreby using model of acetic acid-induced writhing response and anti-inflammatory effect of these three extracts by usingmodel of lambda-carrageenan-induced paw adema in mice.In the analgesic test,methanol extract(10.0 and 1.0 mg/kg)and aqueous extract(10.0 mg/kg)decreased the acetic acid-induced writhing response.In anti-inflammatory test,methanol extract(10.0 and 1.0 mg/kg)and aqueous extract(10.0 mg/kg)decreased the paw edema at the second,third,fourth,fifth,and sixth hour after lambda-carrageenan administration.High perfor mance liquid chromatography result suggested that the analgesic and anti-inflammatory effects of methanol extract might be related to its flavonoid components.

analgesic;anti-inflammatory;aqueous and methanol extracts;flavonoid;Ledum palustreL.

1001-6880(2010)02-0326-04

2009-03-18 接受日期:2009-06-17

＊通訊作者 Tel:86-21-62232019;E-mail:wjqu@bio.ecnu.edu.cn

R285.5;Q946.91

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