文冠果油中植物甾醇的提取及其抑菌特性研究

曹立強,李丹丹,鄧 紅,韓 瑞,田子卿

陜西師范大學食品工程與營養科學學院,西安 710062

文冠果油中植物甾醇的提取及其抑菌特性研究

曹立強,李丹丹,鄧 紅＊,韓 瑞,田子卿

陜西師范大學食品工程與營養科學學院,西安 710062

以文冠果油為原料,采用皂化法提取文冠果植物甾醇。通過均勻試驗設計研究了堿液用量、提取溫度、提取時間等因素對文冠果油中植物甾醇純度和提取率影響,初步確定了皂化法提取工藝條件,并采用抑菌圈法分析了甾醇粗提物對大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、毛霉和青霉的抑菌特性。結果表明,文冠果植物甾醇提取的較佳工藝參數為:濃度 1 moL/L的氫氧化鈉堿液與油用量比為 14︰ 1(mL/g),提取溫度 75℃,提取時間 40 min。文冠果甾醇粗提物對毛霉和青霉無抑制作用,對大腸桿菌和枯草芽孢桿菌有明顯抑制作用,且對大腸桿菌的抑制作用尤為突出,文冠果植物甾醇是一種較好的抗菌劑。

文冠果油;植物甾醇;提取;抑菌特性

文冠果 (Xanthoceras sorbifoliaBunge)是無患子科文冠果屬落葉喬木或大灌木,原產我國北方干旱寒冷地區,早在 1200年前,我國就有利用文冠果資源的記載[1]。文冠果是我國北方地區很有發展前途的珍稀木本油料和水土保持樹種[2],其種子可食用也可榨油,種仁含油 55%～65%,含蛋白質 23%～26%,總碳水化合物8%～9%,總糖2%～3%,文冠果皂甙 0.5%,18種微量元素等,據朱丹、黃玉廣等人的研究表明,文冠果種仁具有很高的營養價值[3]。此外,文冠果種仁油中非皂化部分含有較多的甾醇,具有很高的醫用價值[4]。

植物甾醇是一種類似于環狀醇結構的物質,主要存在于植物油不皂化物中。不同植物油中所含的植物甾醇不一樣,天然植物甾醇主要有 4種,即谷甾醇、豆甾醇、菜油甾醇和菜籽甾醇[5]。植物甾醇對人體的諸多功能及其特有的性質,使植物甾醇及其衍生物在醫藥、食品、化妝品及飼料、畜牧等行業中得到了廣泛的應用,并展現出其獨特效果和良好開拓前景。作為油脂中一種功能性成分,植物甾醇也是油脂工程研究的重要內容之一[6]。

目前有關從文冠果油中提取植物甾醇的工藝的研究尚未報道,且關于植物甾醇的抗菌特性的研究也較少。本項目以冷榨文冠果油后的廢棄油餅為原料制備文冠果油,采用皂化法[7]提取文冠果植物甾醇,以期為文冠果油脂的深度開發及植物甾醇新資源的開辟提供試驗依據。

1 材料和方法

1.1 材料、試劑與儀器

1.1.1 材料

文冠果籽購自陜西省志丹縣特種作物研究所,破殼取仁,以冷榨法制取文冠果種仁油之后的廢棄油餅為原料,粉碎過 40目篩,備用。

1.1.2 試劑

石油醚 (60～90℃),95%乙醇,氫氧化鈉,無水硫酸鈉,乙酸酐,丙酮,酚酞,氫氧化鉀等均為分析純試劑。

1.1.3 試驗菌株

大腸桿菌 (coli)、枯草芽孢桿菌 (B acillussubtilis)、毛霉 (Hairm ould)、青霉 (Penicillium)均由本校生命科學學院微生物實驗室提供。

1.1.4 主要儀器

KQ-200KDE型高功率數控超聲儀:昆山市超聲儀器有限公司;BS224S電子分析天平:北京賽多利斯儀器系統有限公司;DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器:鞏義市英峪予華儀器廠;PHS-3C精密 pH計:上海精密科學儀器有限公司;可見光分光光度儀:尤尼柯(上海)儀器有限公司;高壓滅菌鍋、恒溫培養箱等。

1.2 試驗方法

1.2.1 文冠果油的制備

取一定量的冷榨文冠果廢棄油餅粉置于 500 mL平底燒瓶中,采用超聲輔助溶劑提取法制備文冠果油。以沸程 60～90℃的石油醚為溶劑,文冠果油的提取工藝參數[8]為:料液比 1∶10(g/mL)、提取溫度60℃、提取時間 35 min、超聲波頻率60 kHz,在該工藝條件下浸提四次,得到文冠果油。

1.2.2 文冠果油中植物甾醇的提取

皂化法工藝流程:文冠果油→加堿皂化→萃取溫→濃縮→甾醇粗制品。皂化操作方法:準確稱取文冠果油 15 g置于圓底燒瓶中,按一定比例加入 1 mol/L堿-乙醇溶液,在攪拌下緩慢升溫至一定溫度,恒溫磁力攪拌器中加熱回流 2 h,使油完全皂化且油珠消失,即得皂化液。回收乙醇 20 mL,皂化液加蒸餾水 125 mL冷卻,備用。取皂化液 300 mL,用300 mL乙醚提取 3次,合并乙醚提取液。提取液用80 mL蒸餾水水洗 3次,再依次用 80 mL 0.5 mol/L氫氧化鉀溶液和 80 mL蒸餾水連續洗滌醚液 2次,然后再水洗至加入酚酞指示劑后洗滌液呈無色為止。最后將提取液用無水硫酸鈉干燥,常溫下減壓蒸餾回收乙醚后,得到文冠果油粗甾醇。計算公式:

1.2.3 甾醇抑菌特性

供試菌種為細菌:大腸桿菌、枯草芽孢桿菌;霉菌:毛霉、青霉。

(1)植物甾醇的稀釋:取 0.1 g植物甾醇粗提物注入小試管中,用移液管移取一定量丙酮配制成0.8 g/mL的溶液,以二倍稀釋法再用丙酮配置成 1/ 2倍、1/4倍、1/6倍的溶液備用。

(2)培養基的制備及其滅菌:按照相關方法制備牛肉膏蛋白胨培養基、馬鈴薯培養基,倒平板。平板、移液管和所用的濾紙片等相應器皿在 165℃高溫下滅菌 2 h,蒸餾水、培養基在 121℃的高壓蒸汽鍋中滅菌 20 min。

(3)抑菌試驗:將各菌種于試驗前 16 h活化,從活化的菌種中各取 0.2 mL放入已滅菌的平板中涂布。采用抑菌圈法檢測抑菌效果,以蒸餾水和丙酮作對照,抑菌圈的大小表示了抑菌特性的強弱。

抑菌特性計算方法:

式中:-Φ為三次直徑的平均值;Φ1為對照生長直徑;Φ2為各試驗處理生長直徑;6為濾紙片直徑。

1.3 分析方法

1.3.1 植物甾醇的定性測定

采用金世梅、朱惠等[9]的方法對植物甾醇進行定性分析。

1.3.2 植物甾醇的純度分析

采用改進的 Lebennann-Burchard比色法測定甾醇樣品中總甾醇的含量。

1.4 文冠果油甾醇提取試驗設計

本試驗采用了 U10(53)均勻試驗設計[10]。以粗提物純度為試驗指標,試驗因素分別為堿液用量、溫度、時間,均勻試驗設計如表 1所示。

表 1 U10(53)均勻試驗設計表Table 1 Uniform design table

2(10:1) 3(65) 40 4 2(10:1) 4(70) 50 5 3(12:1) 5(75) 60 6 3(12:1) 1(55) 20 7 4(14:1) 2(60) 30 8 4(14:1) 3(65) 40 9 5(16:1) 4(70) 50 10 5(16:1) 5(75) 60 3

2 結果與分析

2.1 植物甾醇定量分析標準曲線

按照 1.3.2的方法測得甾醇濃度與吸光度的對應值,繪制植物甾醇定量分析標準曲線 (如圖 1所示)。得到曲線的回歸方程為:y=5.37x-0.0279,相關系數 R2=0.986,說明曲線回歸性較好,可進行定量分析。此方法簡單快速,整個操作僅需 0.5 h,適用于工廠的快速測定,實用性強。

2.2 文冠果油皂化粗提物的定性分析

將粗提物溶于氯仿,在試管中,沿管壁緩緩加濃硫酸,則成為兩液層,接界面顯現為玫瑰紅色;再將粗提物溶于乙酸酐,滴加濃硫酸,溶液呈黃綠色。定性分析結果表明所提取的物質中確含有植物甾醇。

圖 1 植物甾醇濃度標準曲線Fig.1 Concentration of standard curve for phytosterol

2.3 文冠果油中植物甾醇的提取試驗

分別以堿液用量、提取溫度、堿的種類為試驗因素,以甾醇提取率、粗提物純度為試驗指標,采用U10(53)均勻試驗設計表進行試驗,結果如表 2所示,將實驗結果經DPS軟件數據處理系統進行二次多項式逐步回歸分析,結果如表 3所示。

表 2 U10(53)均勻設計試驗結果Table 2 Unifor m design experimental results

利用DPS軟件,根據表 2的數據得出甾醇純度與試驗因素的二次回歸方程為:Y1=5.49933333+ 6.770743590X1-8.080410256X2+3.1080000000X3-0.6221794872+1.3705128205,相關系數 Ra= 0.6817,回歸方程顯著性檢驗 p=0.1914>0.1,說明各因素水平對甾醇的提取純度的影響不顯著。

同樣得出甾醇的提取率與試驗因素的二次回歸方程為:

Y2=-1.429528302+2.1452566038X2-0.07165534591-0.3198817610+0.24666666667,回歸方程顯著性檢驗 p=0.0359<0.05,說明各因素水平對甾醇的提取純度的影響顯著。相關系數 Ra=0.8347,所得回歸方程能較好預測皂化法的提取率。

其次,從表 2的結果可知,純度最高時各因素組合與甾醇提取率最高時各個因素組合并不完全相同,綜合考慮純度和提取率,確定試驗較佳條件為:堿液用量 14∶1,提取溫度 75℃,皂化時間 40 min。

表 3 最優條件驗證試驗結果Table 3 Optimal conditions verify experimental results

在較優條件下,實際值得到的文冠果油甾醇純度和提取率均與預測值基本吻合,說明上述試驗條件為文冠果植物甾醇最優提取條件,即堿液用量 14∶1(mL/g),提取溫度 75℃,皂化時間 40 min。此條件下,甾醇的提取率約為 3%,即每噸的廢油餅可以生產30千克的粗甾醇,若按照甾醇在國際市場上的價格來算,其經濟效益以及社會效益比較可觀。

2.4 文冠果油中植物甾醇的抑菌特性

按照 2.2.3的方法進行試驗,文冠果植物甾醇粗提物的抑菌特性試驗結果如表 4所示。

表 4 文冠果油中植物甾醇的抑菌特性試驗結果Table 4 The phytosterol ofShinyleaf yellowhornseed oil phytocholesterol characteristic experimental results

抑菌圈的直徑大小顯示了文冠果植物甾醇粗提物的抑菌效果。由表 4可知,文冠果植物甾醇粗提物對細菌有抗菌特性,對大腸桿菌的抑菌效果要比對枯草芽孢桿菌的抑菌效果好;而文冠果植物甾醇對毛霉和青霉沒有抑菌作用。

此外,文冠果植物甾醇對大腸桿菌的最低抑菌濃度(M IC)為 0.06(mg/mL),在試驗范圍內最大抑制率為 55.88%。抑制枯草芽孢桿菌的文冠果植物甾醇最小濃度為 0.02(mg/mL),在試驗范圍內最大抑制率為 44.95%,與常用防腐劑苯甲酸鈉比較,相同濃度下,后者抑菌效果不如植物甾醇好,并且通過對比,其M IC比植物甾醇M IC普遍偏高。

由于本試驗樣品僅為粗提物,未對文冠果植物甾醇提取物進行分離純化,另外,試驗所選菌種種類較少,無法說明對其他類型菌種有無抑菌效果,需要進一步對甾醇粗提物進行純化,擴大菌種范圍,深入探討其抑菌效果,為食品工業開發新型天然抗菌劑提供試驗依據。

3 結論

(1)文冠果植物甾醇的較佳提取工藝為:所用堿為 1 mol/L的氫氧化鈉,皂化時間 40 min,堿液與油用量比為 14∶1(mL/g),提取溫度 75℃。

(2)文冠果甾醇粗提物對毛霉和青霉無抑制作用,對大腸桿菌和枯草芽孢桿菌有明顯抑制作用,對大腸桿菌的抑制作用尤為突出,文冠果植物甾醇是一種較好的抗菌劑。

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2 Gao QM(高啟明),Hou JT(侯江濤),L I Y(李陽).Cultivated application and developmental prospect ofXanthoceras sorbifoliaBunge.Quarterly of ForestBy-product and Speciality In China(中國林副特產),2005,75,4:56-57.

3 Zhu D(朱丹),HuQ(胡群),LiXB(李霞冰).The research of the shinyleaf yellowhorn's chemical composition prerun and comprehensive utilization.Territory Nat Res Stuty(國土與自然資源研究),1997,1:69-71.

4 Li ZL(李占林).Studies on the chemical constituents of the husks of shinyleaf yellowhorn.J Shenyang Phar m Univ(沈陽藥科大學學報),2005,7:271-272.

5 YanMH(嚴梅和),Li PW(李佩文).The separation identification and determination of the unsaponifiable matters in shinyleaf yellowhorn oils.Sci Silvae Sinic(林業科學),1984, 20:389-396.

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8 Deng H(鄧紅),Qiu NX(仇農學),Sun J(孫俊),et al. Optimization of ultrasonic-assisted extraction technology of oil fromXanthoceras sorborifoliaburge seeds.Transactions of the Chinese Society of Agric Eng(農業工程學報),2007,23: 249-253.

9 Jin S M(金世梅),Zhu H(朱惠),Huang J(黃靜),et al.I-dentification of phytoserin and study on its quantification test.China food additives(中國食品添加劑),2006,3:146-150.

10 Liu KY(劉魁英).Food Research and Data Analysis(食品研究與數據分析).Beijing:China Light Industrial Press, 2005,213-229.

Study on the Extraction and Antibacterial Properties of Phytosterol from the Shinyleaf Yellowhorn Seed O il

CAO Li-qiang,L IDan-dan,DENG Hong,HAN Rui,T IAN Zi-qing
College of Food Engineering and Nutritional Science,Shaanxi Nor m alUniversity,Xi’an 710062,China

Using shinyleaf yellowhorn seed oil as raw materials,the phytosterol was extracted with saponification method.The influence factors such as dosage of alkali,extracting temperature and time to the pureness and extracting ratio of phytosterolwas discussed through the uniform exper imental design,and the purenessof phytosterolwas analyzed through visible light spectrophotometry.At the same time,the antibacterialpropertiesofphytosterol to the E.coli,Bacillus subtilis,Mucor and Penicillium was determined using antibacterial ring method.The results show that the optimal technical parameters are:dosage of alkali liquor(1 moL/L)14 mL/g oil,extracting temperature 75℃,extracting time is40 min. The crude extraction of phytosterol have stronger antibacterial effect on the Escherichia coli and Bacillus subtilis,no effect on theMucor and Penicillium.The shinyleaf yellowhorn phytosterol are better antibacterial agent.

shinyleaf yellowhorn seed oil;phytosterol;extraction;antibacterial properties

1001-6880(2010)02-0334-05

2009-07-06 接受日期:2009-11-27

陜西師范大學優秀科技預研項目(200802020)

＊通訊作者 Tel:029-85310410;E-mail:deng67hongli@sina.com

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