一株銀杏內生真菌菌株的抑菌活性成分研究

周松林,陳雙林,譚光宏,王 華,黃用豪,陳 凡

1海南醫學院熱帶病重點實驗室,海口 571101;2南京師范大學生命科學學院,南京 210046

一株銀杏內生真菌菌株的抑菌活性成分研究

周松林1＊,陳雙林2,譚光宏1,王 華1,黃用豪1,陳 凡1

1海南醫學院熱帶病重點實驗室,海口 571101;2南京師范大學生命科學學院,南京 210046

從銀杏葉柄分離篩選到具抗菌活性的內生真菌 Colletotrichum.SP NTB-2菌株,利用硅膠柱色譜、制備高效液相色譜等方法在其發酵產物中分離到抗枯草芽孢桿菌、鼠傷寒沙門氏菌等具有廣譜抑菌活性的化合物,經MS、NMR等波譜數據確認該活性成分為芹菜素-8-C-葡萄糖苷(apigenin-8-C-β-D-glucopyranoside),該化合物首次從真菌中分離得到。

內生真菌;銀杏;芹菜素-8-C-葡萄糖苷

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器與試劑

1100系列高壓液相色譜儀 (美國 Agilent公司);制備色譜柱:Hichrom C18(10×250 mm,10 μm);Vario ELⅢ元素分析儀 (德國元素分析系統公司)分析;Burker AM 400核磁共振儀 (瑞士 Bruker公司);Autospec VG-3000質譜儀 (美國 Autospec公司);XT-4雙目顯微熔點測定儀(北京泰克儀器有限公司)。

柱色譜用 200～300目硅膠 (Silica G),薄層層析用硅膠 G(均為青島海洋硅膠廠生產),其余試劑均為國產分析純。

1.1.2 菌種

內生真菌NTB-2為本實驗室從江蘇省南通市的銀杏樹葉柄上通過組織分離法獲得的,通過顯微形態觀察,按 Sutton[5]的腔孢綱分類系統鑒定為刺盤孢 Colletotrichumsp.。

大腸埃希氏菌 (Escherichia coliATCC 25922),金黃色葡萄球菌 (StaphylococcusaureusATCC 6538),枯草芽孢桿菌 (Bacillus subtilisATCC 9372),銅綠假單胞菌 (Pseudom onas aeruginosaATCC 27853 ),鼠傷寒沙門氏菌 (Sa lm onella typh im uriumCCG MC 11190),以上均購自江蘇省疾病預防控制中心;不動桿菌 (Acinetobacterspp.B667),洋蔥假單孢菌(Pseodom onas cepacia438),肺炎克雷伯氏菌 B673 (Klebsiella pneum oniae B667),檸 檬 酸 桿 菌(Citrobacter spp.38)、陰溝腸桿菌 (Enterobacter cloacae98-23),以上菌株由江蘇省省人民醫院惠贈。

1.1.3 培養基

快落山的太陽光灑進房間里，有點暗淡，又有點溫暖。齊海峰看著窗外想，周末要不要約她再去一次電影院呢？卻聽她在外面扯著嗓子喊：“老齊，今晚包水餃好不好？”

馬鈴薯葡萄糖(PDA)液體(固體)培養基:馬鈴薯 200 g,葡萄糖 20 g,(瓊脂 18 g),水 1000 mL,自然 pH。LB(Luria Bertani)液體 (固體)培養基:蛋白胨 10g,NaCl 5 g,酵母粉 5 g,(瓊脂 16 g),用 1 mol/ L NaOH調 pH 7.0,重蒸餾水定容至 1000 mL。

1.2 方法

1.2.1 菌株NTB-2發酵

制備馬鈴薯葡萄糖培養液,于500 mL三角瓶中裝液 250 mL。按 1/20接種量將 NTB-2孢子懸液(濃度為 107個/mL)接種到 PDA液體培養基中,26℃、150 r/min下培養 3～5 d后,再接種到 7 L的種子發酵罐 (裝液為5 L)中,26℃、150 r/min下培養5 d后,再放罐到 70 L的中式發酵罐 (裝液為 50 L)中,26℃、150 r/min下培養 7 d。期間不斷補充馬鈴薯葡萄糖液體培養基,使發酵罐內的總體積保持不變。

1.2.2 提取與分離

發酵結束后,用四層紗布濾過,使菌體與發酵液分開,菌體用 70%的乙醇浸泡,浸泡 24 h后用濾紙濾過,濾液減壓濃縮,再用 70%的乙醇浸泡菌體,重復 3次。發酵液用乙酸乙酯萃取 3次,減壓濃縮萃取液,分別得濃縮物 8.3和 4.0 g。

合并菌體和發酵液的提取物共 12.3 g,上硅膠柱,用氯仿:甲醇 (100:0)和氯仿:甲醇 (90:10)梯度洗脫,100 mL收集組分,對各組分進行薄層色譜分離,合并主產物相同的組分,得到粗產品化合物 1為148 mg。粗產品中的2 mg用去做抑菌的實驗,追蹤其活性成分的去向,剩余的然后在通過制備型HPLC進行精制,得到化合物 1為 37.4 mg。

1.2.3 抑菌實驗

本藥敏實驗采用紙片瓊脂擴散法 (K-B法)。將 10種供試菌株標化后 15 min之內接種于藥敏培養基,以無菌棉團蘸取已制備好的細菌菌液,并在管壁上擠壓除去多余的菌液后,向一個方向均勻涂布接種于LB瓊脂平板表面,然后將平板每轉動 60度涂布一次,共涂 3次,最后沿平板邊緣涂布一圈。蓋上平皿蓋,置室溫干燥 3～5 min,待平皿面稍干后用無菌鑷子將含藥紙片平放于含菌瓊脂平板表面,并輕壓使其緊貼在上面。平板經室溫放置 15 min再倒置于 37℃培養箱中,培養 16～18 h后閱讀結果,以上實驗每處理重復 3次。

2 結果與討論

圖 1 化合物 1芹菜素-8-C-葡萄糖苷的化學結構Fig.1 Apigenin-8-C-β-D-glucopyranoside isolated from Colletotrichumsp.NTB-2

2.1 化合物 1的結構鑒定

芹菜素-8-C-葡萄糖苷 黃色粉末,mp.253～260℃。[α18°(c 2,吡啶)。EI-MSm/z(%): 433.4([M]+H),結合1H、13C NMR數據推測其分子式為 C21H20O10。UVnm:272,335,(MeOH +NaOAc)280,375,(MeOH +A ICI3)277,304, 346;1H NMR(DMSO-d6,400 MHz)δ:6.26(1H,s, 3-H),6.64(1H,s,6-H),7.98(1H,d,J=8.4 Hz,2′-H),6.83(1H,d,J=8.8 Hz,3′-H),6.83(1H,d,J= 8.4 Hz,5′-H),7.98(1H,d,J=8.8 Hz,6′-H),13.16 (1H,s,5-OH),10.79(1H,s,7-OH),10.38(1H,s, 4′-OH),3.77(1H,d,J=7.8 Hz,1′′-H),3.61(1H, m,2′′-H),3.36(1H,m,3′′-H),3.61(1H,m,4′′-H),4.67(1H,m,5′′-H),3.24(2H,m,6′′-H);13C NMR(DMSO-d6,100 MHz)δ:163.9(C-2),98.2(C-3),182.1(C-4),160.5(C-5),104.6(C-6),162.6 (C-7),102.4(C-8),156.0(C-9),104.3(C-10), 121.6(C-1′),128.9(C-2′),115.8(C-3′),163.9(C-4′),115.8(C-5′),128.9(C-6′),73.4(C-1′′),70.8 (C-2′′),78.0(C-3′′),70.6(C-4′′),81.9(C-5′′), 61.3(C-6′′)。其理化性質、波譜數據與芹菜素-8-C-葡萄糖苷 (apigenin-8-C-β-D-glucopyranoside)[6-8]的數據一致。

2.2 抑菌結果

化合物 1對各種細菌的抑菌試驗結果見表 1和圖 2～5,化合物 1對所有供試細菌都有明顯的抑菌作用,尤其是對枯草芽孢桿菌、鼠傷寒沙門氏菌、洋蔥假單胞菌作用明顯,其抑菌圈的大小都超過18mm,屬于高度敏感類型;而對大腸桿菌、不動桿菌、檸檬酸桿菌都有明顯的抑菌作用,屬于比較敏感類型;屬于對所測菌高度敏感。

表 1 刺盤孢 Colletotrichumsp.NTB-2的產物對不同細菌的抑菌作用Table 1 Inhibitory effect ofColletotrichumsp.against different bacteria

圖 5 化合物 1對不動桿菌的抑制作用Fig.5 Inhibitory effect of compound 1 againstCitrobacterspp

2.3 討論

銀杏所含的化學成分相當復雜,其中黃酮類和萜內酯是銀杏葉發揮獨特藥理活性的有效成分。其黃酮類苷元主要是:山奈酚、槲皮素、異鼠李素、楊梅醇及木樨素,另外還有少量芹菜素等,它們通常以糖苷形式存在[2,9]。芹菜素-8-C-葡萄糖苷,其天然的產物來源并不是很廣泛,曾在掌葉槭,黃瓜葉、夏至草等少數植物中分離得到,它主要作為一種抗氧化劑,可以清除體內的自由基、超氧化基及抗衰老等作用[6-8,10]。從該菌株的液體培養基中分離到芹菜素-8-C-葡萄糖苷,這也為產芹菜素-8-C-葡萄糖苷提供一種新的來源。但我們看到產量還是不夠,需要進一步的優化其培養條件。雖然目前的文獻還沒有報道從銀杏葉或果實中分離得到芹菜素-8-C-葡萄糖苷。這也可能是因為內生真菌在長期的進化過程中與宿主植物建立了互惠共生關系,不僅參與了植物次生代謝產物的合成,而且有可能獨立承擔一些活性物質的代謝合成,與宿主達到共贏互利的效果。植物內生真菌及其代謝產物的多樣性為我們發現一些結構新穎、活性專一的物質提供了可能,值得我們進一步的深人研究。

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Antibacterial Substances of Endophytic Fungus Isolated fromGinkgo biloba

ZHOU Song-lin1＊,CHEN Shuang-lin2,TAN Guang-hong1,WANG Hua1,HUANG Yong-hao1,CHEN Fan11Hainan Provincial Key Laboratory of TropicalM edicine,Hainan M edical Collge,Haikou 571101,China;2Life Science College of Nanjing Nor m alUniversity,Nanjing 210046,China

To study the antibacterial components from endophytic fungus strain,Colletotrichum.SP NTB-2 fromGinkgo biloba,silica gel column chromatography and pre-HPLC were used for the isolation and purification.A active compound was isolated from the fermentation broth of stains NTB-2 and identified as apigenin-8-C-beta-D-glucopyranoside on the basis of spectral data analysis.

endophytic fungus;Ginkgo biloba;apigenin-8-C-β-D-glucopyranoside

1001-6880(2010)02-0193-04

2009-02-03 接受日期:2009-04-08

國家自然科學基金 (30560160);海南省自然科學基金(808157)

＊通訊作者 Tel:86-898-66893322;E-mail:zhousonglin106@163.com

R965;Q58

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