姜黃素對Saos-2細胞增殖和凋亡的影響

吳燕峰，梁新軍，郭 宇，夏 侃，夏仁云，沈慧勇

骨肉瘤是最常見的骨的原發性惡性腫瘤，好發于青少年，對化療和放療等傳統治療方法敏感性低，預后較差，易復發和轉移，5年生存率低［1］。為此，發現并建立新的、有效的骨肉瘤的防治措施勢在必行。

姜黃素(Curcuma)是一種從植物根莖中提取的多酚類化合物，主要具有抗氧化、抗炎及抗腫瘤等多種生物學功能［2］。近年來，國內外研究表明［3－5］，姜黃素在體外對多種腫瘤細胞的生長具有抑制作用，但其機制尚不十分明確。本實驗探討了姜黃素對人骨肉瘤Saos-2細胞的增殖抑制和誘導凋亡的影響并檢測了其對凋亡相關基因Fas表達的調控，為進一步明確姜黃素的抗腫瘤機制提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑 DMEM培養基、新鮮小牛血清為Gibco公司產品;姜黃素購自美國 Sigma公司，用DMSO溶解配制成0.01 mol·L－1的儲存液分裝備用，使用時用無血清DMEM培養基稀釋到所需濃度，DMSO的含量小于0.1%;四甲基偶氮唑藍(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)、胰酶均為美國Sigma公司產品;Fas兔抗人多克隆抗體為美國Santa Cruz公司產品。

1.2 細胞培養 人骨肉瘤細胞系Saos-2培養于含10%新鮮小牛血清的DMEM培養基中，置于37℃，5%CO2飽和濕度的培養箱中培養，細胞呈貼壁生長。

1.3 MTT實驗 取對數生長期的Saos-2細胞，用含10%小牛血清的DMEM培養液配成單個細胞懸液，以每孔1×104接種于96孔培養板。培養板置于37℃，5%CO2飽和濕度的培養箱內培育，使細胞增殖至鋪滿每孔底部。實驗分空白對照組和姜黃素作用組(5、10、20、40 μmol·L－1)，每組設 3 個復孔。分別在 37℃、5%CO2培養箱中培養 24、48、72 h后，每孔加入20 μl MTT(5 g·L－1)，繼續在 37℃、5%CO2培養箱中培養4 h。吸盡上清，再加入DMSO 150 μl，振蕩10 min，使其充分溶解，在96 孔酶標儀上測定波長490 nm的吸光度(A)，計算細胞生長抑制率。計算公式為:細胞生長抑制率/%=(比色對照組吸光度平均值－實驗組吸光度平均值)/比色對照組吸光度平均值×100%。

1.4 流式細胞儀檢測細胞凋亡 選取對數生長期的Saos-2細胞分別接種于6孔板中，分組同上，每組作用48 h，各組重復3次。胰酶消化，收集1×106細胞，1 000 r·min－1離心5 min，棄上清。用70%乙醇1 ml固定。離心，棄上清。PBS洗2遍。加入適量Annexin V-FITC和PI，避光染色0.5 h。上機檢測，分析 5 ～40 μmol·L－1細胞凋亡率。

1.5 Hoechst 33258檢測細胞凋亡 選取對數生長期的Saos-2細胞接種于6孔板，行細胞爬片，采用經MTT和流式檢測作用最明顯的20 μmol·L－1姜黃素作用，含等體積DMSO的DMEM培養基作為對照。收集作用后48 h的細胞，PBS洗2次，用75%的乙醇4℃固定5 min，PBS沖洗，Hoechst 33258染色10 min后置于熒光顯微鏡下觀察。

1.6 Western blot分析細胞Fas蛋白表達的變化收集不同濃度姜黃素作用48 h后的Saos-2細胞約1×107，提取其胞質蛋白;取50 μg蛋白質樣品進行SDS-PAGE電泳，并轉至硝酸纖維膜上，5%封閉液室溫封閉2～4 h后，用含0.05%Tween-20的TBS緩沖液(TBST)漂洗3次，每次10 min，加入相應的兔抗人Fas多克隆抗體(1∶1 000)，4℃孵育過夜，TBST漂洗3次，每次10 min，再加入相應的辣根過氧化物標記的二抗(1∶500)，37℃搖床溫育2 h，增強化學發光顯色系統顯色，重復實驗3次。

2 結果

2.1 姜黃素對骨肉瘤細胞的增殖抑制作用 不同濃度姜黃素對Saos-2細胞的生長有不同程度的抑制，濃度越高，作用時間越長，抑制作用越明顯，光學顯微鏡下，姜黃素作用后的Saos-2細胞出現皺縮、變圓、脫落;部分細胞體積縮小，貼壁細胞數量減少。當姜黃素濃度為20 μmol·L－1時抑制作用明顯增強，與對照組相比，差異有顯著性(P＜0.05)。見Fig 1。

Fig 1 The proliferation inhibition of Saos-2 cells induced by curcumaThe inhibition rate rised significantly when the concentration of curcuma was over 20 μmol·L－1，*P ＜0.05 vs control

2.2 姜黃素誘導骨肉瘤細胞凋亡 Annexin V/PI雙染檢測可區分壞死與凋亡的細胞，本實驗我們使用此方法檢測顯示不同濃度姜黃素可以誘導Saos-2細胞凋亡。當姜黃素濃度為20 μmol·L－1時，細胞凋亡率明顯升高(P ＜0.05)，濃度為 40 μmol·L－1時，凋亡率與control組比較明顯升高，但與姜黃素20μmol·L－1組比較差異無顯著性(P ＞0.05)。見Fig 2。

Fig 2 The apoptosis of human osteosarcoma cells Saos-2 induced by curcuma was detected by flow cytometryThe effect rised significantly when the concentration of curcuma was over 20 μmol·L －1.*P ＜0.05 vs control

2.3 Hoechst 33258熒光染色法觀察細胞形態學改變 熒光顯微鏡觀察，發現20 μmol·L－1姜黃素作用后，Saos-2細胞胞核出現核固縮、碎裂，產生凋亡小體，如Fig 3所示。

Fig 3 The morphological alteration after treated with curcuma was confirmed by Hoechst 33258 stainingA:Control;B:Treated with 20 μmol·L －1curcuma

2.4 姜黃素對骨肉瘤細胞Fas蛋白表達的影響Western blot檢測姜黃素作用前后骨肉瘤細胞Fas蛋白表達變化，顯示Fas在人骨肉瘤細胞中呈低表達，姜黃素處理細胞48 h后，骨肉瘤細胞的Fas蛋白表達強度較前增高，且其作用隨姜黃素濃度增高而明顯(Fig 4)。

Fig 4 The protein expression of Fas after treated with curcuma

3 討論

骨肉瘤為最常見的嚴重危害青少年健康的惡性腫瘤之一。盡管近年來臨床治療取得了很大進展，但死亡率和致殘率仍然很高。如何延緩其生長及轉移，進一步提高其治療效果仍是骨肉瘤治療的難題之一［6］。尋找具有高抗腫瘤活性的新型藥物是目前骨肉瘤的研究熱點之一。

姜黃素是一種多酚類物質，近年來研究發現姜黃素具有潛在的抗腫瘤作用而得到廣泛的關注。目前認為姜黃素主要通過(1)抑制腫瘤血管生成;(2)上調caspases蛋白酶誘導凋亡;(3)抑制核轉錄因子的表達;(4)誘導細胞周期阻滯;(5)調節凋亡抑制基因的表達等多種機制起到誘導腫瘤細胞凋亡而對腫瘤起到治療作用［3～5］。

在本實驗中，我們采用不同濃度的姜黃素體外作用于人骨肉瘤系Saos-2，通過MTT檢測細胞增殖發現，不同濃度姜黃素可以抑制骨肉瘤細胞的增殖，且其抑制率與姜黃素的濃度和作用時間有關，當姜黃素濃度為20 μmol·L－1，作用時間48 h時抑制作用明顯增強，與對照組相比，差異有顯著性(P＜0.05，見Fig 1)。與國外其他學者研究結果相似［7］，提示姜黃素可以體外抑制骨肉瘤細胞的增殖，對骨肉瘤細胞起到殺傷作用。

目前認為，細胞凋亡是細胞監測系統重要的組成部分。在細胞凋亡的早期細胞膜表面的磷脂酰絲氨酸(PS)從膜內轉移到膜外，Annexin V可與PS結合，而在早期凋亡階段細胞胞膜是完整的，PI不能通過胞膜，只有在細胞壞死時才可進入胞內與胞核中的核酸結合發出熒光。因此Annexin V和PI雙染可作為凋亡檢測的有力手段［8］。我們的流式結果顯示，姜黃素可體外誘導人骨肉瘤細胞Saos-2發生凋亡，且其凋亡率隨著姜黃素濃度的增加而增加。Hoechst 33258可透過細胞膜并對DNA染色而發出強烈的藍色熒光，常用來進行凋亡細胞的形態學檢測。我們通過熒光顯微鏡下觀察顯示20 μmol·L－1的姜黃素可誘導骨肉瘤細胞發生凋亡，細胞核胞核固縮、碎裂，出現凋亡小體。這些結果都說明，姜黃素可以誘導骨肉瘤細胞的凋亡。

研究表明，腫瘤壞死因子(TNF)超家族的成員Fas與其天然配體(Fa sL)或相應單克隆抗體相結合，通過激活胱冬酶(Caspase)家族等過程完成細胞凋亡信號傳遞，是細胞凋亡的主要途徑之一［9］。我們通過Western blot檢測發現Fas蛋白在人骨肉瘤細胞Saos-2中呈低表達，而經過姜黃素作用后，Fas蛋白與對照組相比明顯增強，提示姜黃素通過上調Fas的表達，增加骨肉瘤細胞對凋亡誘導的敏感性，重新啟動了腫瘤細胞凋亡的級聯反應，加速腫瘤細胞凋亡，從而達到腫瘤治療的目的。

綜上所述，姜黃素可以抑制骨肉瘤細胞Saos-2增殖，并誘導其凋亡，作用機制涉及上調Fas蛋白表達，可能啟動了細胞凋亡的信號轉導的級聯過程有關。

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［4］謝朝陽，祝其鋒，吳斌華.姜黃素影響Aβ_(25－35)誘導PC12細胞周期變化與細胞凋亡的可能機制［J］.中國藥理學通報，2009，25(2):217 －21.

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