Akt/PKB對哮喘小鼠Fas表達的調節作用

張寶輝，朱小兵，劉曉湘，方秀斌

支氣管哮喘是由非特異性炎癥引起的以氣道高反應性和氣道炎癥為主要特征的慢性炎癥疾病。其發病機制比較復雜，許多炎性細胞因子、介質等均參與其發病過程。研究證明，神經營養因子(nerve growth factor，NGF)是通過作用于炎癥細胞、神經元，參與哮喘時的氣道炎癥反應、氣道收縮和氣道高反應性的。最近有研究報道，Akt/PKB參與了哮喘發病機制中NGF介導的信號傳導通路，我們既往的實驗［1］也證明了Akt/PKB能上調肺及C7-T5段脊神經節及相應脊髓后角IL-1β的表達，以及肺組織內血管內皮細胞生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的表達［2］，說明 Akt/PKB 很可能通過對細胞因子IL-1β和VEGF的表達來參與NGF介導的哮喘發病機制，而Akt/PKB作為磷酸肌醇3激酶(phosphatidylinositol 3 kinase，PI3K)的一個重要的下游調節激酶，在細胞抗凋亡過程中亦起著重要的作用，它是否通過調節細胞凋亡信號的轉導來參與NGF介導的哮喘發病機制呢?凋亡因子Fas分子可在多種細胞廣泛表達，具有介導細胞凋亡、調節炎癥反應及多種免疫生理病理作用，有研究證明［3］，皮質激素及平喘靈均可通過調節Fas的表達來誘導哮喘模型肺組織嗜酸性粒細胞、淋巴細胞等炎癥細胞的凋亡，進而實現支氣管哮喘的治療，咳喘羅通過上調EOS內Fas蛋白、肺組織內FasL以及下調EOS內Bcl-XL的表達來誘導或加速EOS凋亡［4］，T細胞表達Fas不足可以導致小鼠形成長期過敏性氣道炎癥，提示人的T細胞內缺少Fas受體也能夠導致哮喘［5］，炎癥期和纖維化期大鼠肺組織細胞凋亡率增加，Fas/FasL表達增多，而燈盞花素能明顯降低肺組織的凋亡率，下調Fas/FasL的陽性表達［6］。但Akt/PKB能否通過調節Fas分子的表達參與哮喘仍未見文獻報道，本研究利用免疫熒光、Western blot方法檢測Fas的表達，了解Akt/PKB在哮喘的發病中能否調節Fas分子的表達。

1 材料與方法

1.1 實驗動物分組及模型制備 ♂BALB/c小鼠30只，由首都醫科大學實驗動物中心提供。按隨機數字表法分為:①哮喘組10只，d1每只小鼠腹腔注射20 μg OVA(Sigma公司)和2 mg氫氧化鋁混合于0.5 ml PBS中，d 8、d 15每只小鼠腹腔注射10 μg OVA和1 mg氫氧化鋁混合于0.5 ml PBS中，d16開始將小鼠置于封閉容器中，給予4%OVA(PBS配成)霧化吸入激發哮喘發作，每天1次，每次25 min，連續7 d;②Akt/PKB阻斷組，d19開始霧化吸入前3 h鼻腔給Akt/PKB阻斷劑-LY-294002(0.3 mg·kg－1)，其余均與哮喘組相同;③ 正常對照組，以PBS代替OVA注射和霧化吸入，其余均與哮喘組相同。各組最后1次激發后24 h處死。

1.2 肺功能儀測氣道反應性 用0.4%的戊巴比妥鈉腹腔麻醉小鼠(80 mg·kg－1)，疼痛反射消失后固定在小鼠體描箱內操作臺上，氣管插管，呼吸比15∶10，呼吸頻率90次/分，游離頸外靜脈，行靜脈穿刺，固定針柄，封閉體描箱。乙酰甲膽堿(mACh)用磷酸緩沖液(0.1 mol·L－1pH 7.4)配成0.025、0.05、0.075、0.1 mg·ml－1經頸外靜脈各注射 0.1 ml記錄波形和數據。

1.3 免疫熒光 動物用0.4%的戊巴比妥鈉腹腔麻醉(40 mg·kg－1體質量)，用4%多聚甲醛灌流固定，將組織后固定24 h，移入30%蔗糖緩沖液中至標本下沉，OCT包埋，恒冷箱切片機連續切片(片厚8 μm)，冷風干燥后，室溫下血清封閉20 min，甩干，滴加一抗Fas(購自武漢博士德生物公司)工作濃度為1∶150，4℃孵育過夜，PBS充分洗滌，滴加工作濃度為1∶100 FITC標記的二抗(購自Sant Crutz公司)，孵育40 min，PBS充分洗滌，甘油封片，用 O-lympus BX51型熒光顯微鏡進行觀察。綠色熒光為陽性表達。

1.4 Western blot免疫蛋白印記 動物用0.4%戊巴比妥鈉腹腔麻醉(40 mg·kg－1)，取C7-T5節段脊神經，置于裂解液中機械勻漿，4℃ 17 000 r·min－1離心1 h，吸出上清液，棄去沉淀。用考馬斯亮藍G250結合法，根據已知牛血清白蛋白溶液的濃度及其吸光度和樣品吸光度計算出樣品蛋白濃度和加樣量。加入樣品緩沖液，然后將樣品置于沸水浴中加熱5 min使蛋白質變性。將制備好的樣品置于－20℃冰箱備用。制備12%分離膠，4%濃縮膠，用微量加樣器將樣品加在凝膠表面樣品槽中。電泳后濕轉至硝酸纖維素膜上。5%脫脂奶粉TTBS緩沖液4℃過夜。一抗Fas、β-actin(1∶200)室溫孵育2 h，洗膜，辣根酶標記羊抗兔 IgG-HRP(1∶5 000，Santa Cruz)室溫孵育1 h，洗膜后加入 ECL(enhanced chemiluminescence)試劑(Santa Cruz)反應1 min，暗室曝光顯影后沖洗膠片。凝膠成像分析系統上攝像分析，測得目標帶的IDV，進而計算出各組樣品Fas目標帶的IDV與內參照β-actin IDV的比值。

1.5 統計學處理 采用SPSS 13.0統計軟件對數據進行統計分析，結果用±s表示，組間比較進行t檢驗。

2 結果

2.1 哮喘模型制作結果 本實驗中正常對照組霧化吸入生理鹽水后無明顯哮喘反應，哮喘組動物在霧化吸入卵蛋白3次后，大部分哮喘發作，表現為呼吸頻率加深加快，肋間隙凹陷，刺激性嗆咳;Akt/PKB阻斷組動物，前3次霧化吸入卵蛋白后，大部分哮喘發作，應用阻斷劑后，誘喘反應不明顯。

2.2 肺功能儀測氣道阻力 哮喘組小鼠對mACh的濃度反應曲線明顯上移，其呼氣阻力和吸氣阻力明顯高于正常組(P＜0.01)，證明哮喘模型建立成功;Akt/PKB阻斷組對mACh的濃度反應曲線明顯低于哮喘組(P＜0.01)，提示Akt/PKB對哮喘的氣道高反應有調節作用。

Fig 1 Values of inpiratory resistence(Ri)measured by AniRes 2005 meter

Fig 2 Values of expiratory resistence(Re)measured by AniRes 2005 meter

2.3 免疫熒光結果 從圖片上可以看出，哮喘組小鼠的C7-T5節段脊神經節(Fig3 1b)和相應節段脊髓后角(Fig3 2b)的Fas蛋白表達量明顯低于正常對照組，顯微圖像分析也證明，哮喘組Fas陽性反應產物MOD值明顯低于對照組。Akt/PKB阻斷組小鼠C7-T5節段脊神經節(Fig3 1c)、C7-T5節段脊髓后角(Fig3 2c)的Fas的表達量明顯高于哮喘組的表達量。顯微圖像分析表明，Akt/PKB阻斷組Fas陽性反應產物MOD值明顯高于哮喘組(P＜0.01，Tab 1)。

Fig 3 The expression of Fas was observed by immunofluorescenceThe expression of Fas in the C7-T5spinal ganglia of(1a):normal control group;(1b):asthmatic group;(1c):Akt/PKB blocked with LY294002 group.The expression of Fas in the C7-T5spinal dorsal horn of(2a):normal control group;(2b):asthmatic group;(2c):Akt/PKB blocked with LY294002 group

Tab 1 Comparison of MOD values of Fas immunoreactivity in all group±s)

Tab 1 Comparison of MOD values of Fas immunoreactivity in all group±s)

＊＊P＜0.01 vs control group;##P＜0.01 vs asthmatic group

Group Spinal ganglia of C7-T5 Spinal dorsal horn of C7-T5 Normal control 37.68 ±1.15## 20.16 ±1.46##Asthmatic 18.25 ±0.76＊＊ 9.52 ±0.83＊＊Akt/PKB blocked with LY294002 24.36 ±1.21＊＊## 13.18 ±0.52＊＊##

2.4 Western blot結果 與正常對照組相比，哮喘組小鼠C7-T5脊神經的Fas蛋白表達量明顯減少(P＜0.05)，而Akt/PKB阻斷組Fas蛋白表達量比哮喘組明顯增加(P＜0.05)，說明經鼻腔滴入Akt/PKB阻斷劑(LY-294002)效果比較確切(Fig 4)，各組樣品Fas目標帶的IDV與內參照IDV的比值見Tab 2。

Tab 2Comparison of Fas(IDV)/β-actin(IDV)±s)

Tab 2Comparison of Fas(IDV)/β-actin(IDV)±s)

*P＜0.05 vs control group;#P＜0.05 vs asthmatic group

Group C7-T5spinal cord Normal control 2.527 ±0.021#Asthmatic 2.011 ±0.020*Akt/PKB blocked with LY294002 2.256 ±0.018#*

Fig 4 The expression of Fas and β-actin was detected by Western blot.1:Normal control group;2:Asthmatic group;3:The asthmatic mice blocked with LY-294002 group

3 討論

本室以往的實驗發現［7－9］，NGF 能夠上調哮喘小鼠體內SH2-Bβ和Akt的表達，提示在NGF介導的哮喘發病機制中，NGF上調其下游底物SH2-Bβ和Akt的表達是它參與哮喘發病機制調節的途徑之一，以往的研究證明Akt/PKB能上調肺及C7-T5段脊神經節及相應脊髓后角內IL-1β的表達，也能上調肺組織內VEGF的表達，說明Akt/PKB很可能通過對細胞因子IL-1β和VEGF的表達來參與哮喘的發病機制。

從免疫熒光結果可以看出，哮喘組小鼠的C7-T5節段脊神經節和相應節段脊髓后角的Fas的熒光表達量明顯低于正常對照組，而Akt/PKB阻斷組小鼠的Fas的熒光表達量亦明顯高于哮喘組，但較對照組則明顯降低，而Western blot結果也證明，哮喘組小鼠C7-T5脊神經的Fas蛋白表達量與正常對照組相比明顯減少(P＜0.05)，而Akt/PKB阻斷組Fas蛋白表達量比哮喘組明顯增加(P＜0.05)，結果提示Akt/PKB很可能是通過上調Fas的表達來參與NGF介導的哮喘發病機制。

本實驗的結果提示利用Akt阻斷劑直接或間接調節Fas的表達可能是治療哮喘的新途徑。

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