殼寡糖抗小鼠腦缺血/再灌注作用研究

孫雅煊，劉 婷，戴雪伶，高兆蘭，魏 榮，鄭秋生，姜招峰

殼寡糖(chitooligosaccharides，COS)，系指由甲殼素或殼聚糖經水解后產生的一類聚合度低且可溶于水的氨基糖類化合物，可被機體吸收利用。殼寡糖不僅具有甲殼素和殼聚糖相似的性質，而且一些生理活性或功能更為明顯，甚至顯示出甲殼素和殼聚糖所不具備的生理活性［1］。

國內外研究表明，殼寡糖具有抗氧化、神經保護、抗腫瘤、抗炎、抗菌、抗感染等多種藥理作用。雖已有多位學者證實［2－10］殼寡糖的神經保護活性，但絕大部分實驗僅局限于細胞水平，很少有研究者在整體水平探討其活性。殼寡糖能通過血腦屏障［11］，而且腦缺血后血腦屏障的通透性增加［12］，故我們推測殼寡糖能有效地進入大腦，治療腦血管疾病。

本研究采用線栓法建立小鼠大腦中動脈栓塞模型，旨在驗證灌胃給予殼寡糖是否具有抗腦缺血/再灌注損傷作用，并探討其可能機制，為將殼寡糖開發成神經保護劑提供整體水平的依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 ♂ ICR小鼠，體質量25～28 g，北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證號:SCXK(京)2007-001。自然光照周期飼養，術前12 h禁食，自由飲水。

1.1.2 藥品及試劑 殼寡糖(純度≥90%，平均分子質量1 500，脫乙酰度≥90%):北京聯合大學生物化學工程學院;紅四氮唑(2，3，5-triphenyltetrazolium chloride，TTC):北京拜爾迪生物技術有限公司;丙二醛(MDA)、羰基、超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽－過氧化物酶(GSH-Px)、考馬斯亮蘭試劑盒:南京建成生物工程研究所;其它試劑均為國產分析純。

1.1.3 實驗儀器 水浴鍋:北京市長風儀器儀表公司;多功能酶標儀:Sigma公司;TGL 16M離心機:湖南凱達科學儀器有限公司;渦旋混合器:金壇市醫療器械廠。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及給藥 將小鼠隨機分為6組，即假手術組、模型組、依達拉奉(3 mg·kg－1，陽性對照藥)組及殼寡糖高、中、低劑量(200、100、50 mg·kg－1)組。藥物用前溶于蒸餾水，按照10 ml·kg－1體質量灌胃給藥，每天1次，連續7 d，末次給藥后1 h制備腦缺血/再灌注模型。

1.2.2 局灶性腦缺血/再灌注模型的制備［13－15］采用線栓法制備小鼠左側大腦中動脈栓塞模型。用4%水合氯醛(400 mg·kg－1)腹腔注射，麻醉小鼠，頸部皮膚去毛消毒后作正中切口，分離出左側頸總動脈、頸內動脈和頸外動脈，結扎頸外動脈，在頸總動脈上開一小口，將一頭端用硅橡膠包裹的直徑為0.11 mm的魚線沿頸總動脈，經頸內動脈向顱內插至大腦中動脈分叉處，插入深度約12～13 mm，結扎頸內動脈和頸總動脈，固定魚線，縫合皮膚。缺血2 h后將魚線拉出至頸內外動脈分叉處，即實現再灌注。假手術組僅分離頸總動脈、頸外動脈和頸內動脈，但不插入魚線。小鼠蘇醒后出現手術對側肢體運動障礙即為模型制備成功。

1.2.3 神經功能缺陷評分 參照Longa的5分制評分標準進行神經功能缺陷評分。0分:正常，無神經損傷癥狀;l分:不能完全伸展對側前爪;2分:提尾后向外側轉圈;3分:行走時向對側傾倒;4分:不能自發行走或意識喪失。

1.2.4 腦梗死面積測定 缺血2 h再灌22 h后，迅速將小鼠斷頭，取出完整前腦，冠狀切成1.5 mm厚的腦片，于0.5%TTC溶液中37℃水浴孵育15 min。然后置于10%的中性甲醛溶液中固定。對每腦片正反兩面進行掃描，用圖像分析軟件Photoshop 6.0求出梗死區和非梗死區面積。

1.2.5 生化指標測定 小鼠斷頭取腦，去除嗅腦、腦干、小腦后將大腦分別置于勻漿器中，用冰生理鹽水按質量與體積比為1∶9的比例冰浴下制備成體積分數為10%的腦組織勻漿，立即放入－20℃冰箱中保存。按照南京建成生物工程研究所提供的試劑盒說明書測定腦組織中MDA、羰基含量、SOD、CAT及GSH-Px活性。蛋白質含量采用考馬斯亮藍法測定。

1.2.6 統計學處理 采用 SPSS13.0 For Windows統計軟件進行分析。實驗數據均以±s表示，多組間數據比較采用單因素方差分析，兩組間數據比較采用t檢驗。

2 結果

2.1 殼寡糖對腦缺血/再灌注小鼠神經功能缺陷評分和腦梗死面積的影響 從Fig 1及Fig 2可以得知，腦缺血/再灌注后，模型組和給藥組小鼠顯現出明顯的神經功能缺陷癥狀、腦組織梗死。殼寡糖呈劑量依賴性地降低神經功能缺陷評分和腦梗死面積，尤其是殼寡糖高、中劑量(200、100 mg·kg－1)組與模型組差異有顯著性(P＜0.05或P＜0.01)。

2.2 殼寡糖對腦缺血/再灌注小鼠MDA和羰基含量的影響 Fig 3和Fig 4中數據顯示腦缺血/再灌注后，模型組MDA和羰基含量明顯增多，與假手術組比較差異有顯著性(P＜0.01)，表明腦組織遭受嚴重的氧化損傷。殼寡糖高、中劑量組的MDA和羰基含量減少，與模型組相比差異有顯著性(P＜0.05或P＜0.01)。

Fig 1 Effect of chitooligosaccharides on neurological deficit scores in mice subjected to cerebral ischemia/reperfusion(±s，n=9)＊＊P ＜0.01 vs model group.

Fig 2 Effect of chitooligosaccharides on brain infarct size in mice subjected to cerebral ischemia/reperfusion(±s，n=9)*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs model group.

Fig 3 Effect of chitooligosaccharides on MDA content in mice subjected to cerebral ischemia/reperfusion(±s，n=9)＊＊P ＜0.01 vs model group.

2.3 殼寡糖對腦缺血/再灌注小鼠抗氧化物酶活性的影響 Tab 1中結果顯示，模型組小鼠腦組織中SOD、CAT及GSH-Px活性低于假手術組，說明缺血/再灌注引起自由基過度增加，消耗更多的抗氧化物酶。殼寡糖高劑量(200 mg·kg－1)組與模型組比較，3種抗氧化物酶活性均增加，差異有顯著性(P＜0.01)。殼聚糖各劑量組與模型組相比較，3種抗氧化物酶活性呈劑量依賴性的上升。

Fig 4 Effect of chitooligosaccharides on carbonyl content in mice subjected to cerebral ischemia/reperfusion±s，n=9)*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs model group.

Tab 1 Effect of chitooligosaccharides on antioxidant enzyme activities in mice subjected to cerebral ischemia/reperfusion± s，n=9)

Tab 1 Effect of chitooligosaccharides on antioxidant enzyme activities in mice subjected to cerebral ischemia/reperfusion± s，n=9)

*P ＜0.05，＊＊P＜0.01 vs model group.

Group Dose/mg·kg－1 SOD/U·mg－1Pro CAT/U·mg－1Pro GSH-Px/U·mg－1Pro Model / 59.66 ±6.42 6.09 ±0.54 690.19 ±80.06 Sham / 81.66 ±3.88＊＊ 8.33 ±0.44＊＊ 1047.76±49.61＊＊Chitooligosaccharides 200 76.25±6.57＊＊ 7.28±0.70＊＊ 893.39±99.09＊＊Chitooligosaccharides 100 70.72 ±8.97* 6.53 ±0.49 797.07 ±88.87*Chitooligosaccharides 50 62.67 ±8.74 6.25 ±0.63 712.71 ±58.06 Edaravone 3 78.52±5.03＊＊ 7.65±0.57＊＊ 910.62±57.66＊＊

3 討論

腦血管疾病是人類三大死亡原因之一，嚴重危害人類的健康［16］。近年來，糖類物質被證實具有治療腦血管疾病作用［17］。殼寡糖是天然糖中唯一大量存在的堿性氨基寡糖，水溶性好，安全無毒，容易被機體吸收，很有可能在抗腦缺血/再灌注損傷中有出色的表現［18］。本研究通過建立的小鼠局灶性腦缺血/再灌注模型，首先觀察到殼寡糖高、中劑量(200、100 mg·kg－1)組明顯改善小鼠神經功能缺陷，降低腦梗死面積，與模型組差異有顯著性(P＜0.05或P＜0.01)。驗證了殼寡糖能有效地通過血藥屏障，發揮其神經保護作用。

腦缺血/再灌注可引起腦內氧化應激，造成脂質、蛋白質等生物大分子氧化損傷。本研究結果顯示殼寡糖高、中劑量(200、100 mg·kg－1)組可降低腦缺血/再灌注小鼠腦組織中氧化產物MDA和羰基的含量，與模型組相比差異有顯著性(P＜0.05或P＜0.01)，原因可歸于以下幾點。

殼寡糖能有效地清除腦組織內的羥自由基、超氧陰離子及過氧化氫等自由基，一是因為殼寡糖能提供正電子與自由基反應，將自由基轉化為更為穩定的產物，從而終止自由基鏈式反應;二是由于殼寡糖形成分子內氫鍵能力較弱，羥基和氨基容易被激活，有利于清除自由基［19－21］。

腦缺血過程中，局部腦組織金屬離子沉積引起活性氧生成增多［22］。由于殼寡糖分子中羥基、氨基及酰氨基等基團的存在，它可以依靠氫鍵或鹽堿形成具有類似網狀結構的籠形分子，從而能有效地螯合金屬離子，抑制金屬離子催化自由基的生成［23］。徐魏等［11］就曾報道殼寡糖能螯合Cu等過渡態金屬離子，并能清除人體自由基。此外，本實驗數據表明，與模型組相比，殼寡糖高劑量(200 mg·kg－1)組可明顯提高腦缺血/再灌注小鼠腦組織內SOD、CAT和GSH-Px活性(P＜0.01)。這3種抗氧化酶作為體內第一道抗氧化防御系統，其活性的上調可催化更多的自由基轉化為非毒性物質。

綜上所述，殼寡糖對腦缺血/再灌注損傷具有拮抗作用，與其抗氧化活性有關。

本實驗僅在體內初步證實了殼寡糖能減輕腦缺血所致氧化損傷，至于殼寡糖如何通過血腦屏障，殼寡糖在腦內的分布以及篩選合適分子量的殼寡糖等工作，還有待進一步開展。

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