氧化還原調控在紫檀芪誘導HeLa細胞內質網凋亡途徑中的作用

王曉琴，王振華，劉 梅，張 波

在尋找抗癌藥物過程中，膳食源性多酚類物質因容易獲取且不良反應較低而成為人們關注的目標［1］。這使得來源于葡萄等植物的芪類物質(stilbenes)成為抗腫瘤藥物研究的一個熱點。近年來，白藜蘆醇(芪三酚)作為芪類物質的代表被證明具有很好的抗氧化及抗腫瘤活性［2］。白藜蘆醇甲基化后的產物紫檀芪(Pterostilbene，Fig 1)也被發現具有較好的體內抗腫瘤轉移活性［3］。但紫檀芪的抗腫瘤機制研究較少，尤其是在調控腫瘤細胞內氧化還原狀態及氧化還原敏感型凋亡通路等方面尚未有研究。因此本研究擬以人宮頸癌HeLa細胞為模型，研究氧化還原調控在紫檀芪誘導HeLa細胞凋亡過程中的作用及其對內質網途徑的影響。

Fig 1 Structure of trans-pterostilbene

1 材料與方法

1.1 材料 人宮頸癌細胞株HeLa細胞購自中科院上海細胞所。紫檀芪Trans-pterostilbene(Pte)、過氧化氫酶(CAT)、GSH合成前體物質——N-乙酰半胱氨酸(NAC)、超氧陰離子淬滅劑——Tempol(Tmp)、內質網脅迫陽性對照藥——反式4，5-二羥基-1，2-二噻烷(DTTox)、谷氨酰半胱氨酸合成酶抑制子 L-S，R-buthionine sulfoximine(BSO)、0.25% 胰酶-EDTA溶液、硫異氰酸羅丹明(SRB)、DMSO、Hoechst、PI、H2DCFDA 均購自 Sigma公司。CMFDA 試劑盒購自Invitrogen公司。SDNAClear核酸染料購自BBI。小牛血清購于杭州四季青生物工程材料有限公司。DMEM為Hyclone公司產品。TRIzol試劑盒(UNIQ-10)購自上海生工，RevertAid H Minus反轉錄試劑盒購自Fermentas公司。紫檀芪溶解在DMSO中配制成200 mmol·L-1母液，4℃保存。

1.2 主要儀器 蔡司倒置熒光顯微鏡(德國)，凝膠成像系統Gel Doc XR(BIO-RAD，美國)，PCR儀(Enppendorf，德國)，熒光酶標儀 Varioskan Flash(Thermo，美國)用于本實驗。

1.3 細胞培養條件 HeLa細胞于37℃、5%CO2、飽和濕度的CO2培養箱中培養。使用含有體積分數為10%的熱滅活小牛血清的DMEM培養液。指數生長期細胞用于藥物處理。

1.4 SRB法檢測紫檀芪對HeLa細胞增殖的影響細胞用Fig 2所示不同濃度紫檀芪處理24、48、72 h后，以SRB方法在酶標儀上測定細胞反應液的OD值(490 nm)并計算細胞生長抑制率［4］。

1.5 細胞凋亡檢測 通過DNA特異熒光染料染色觀察核凋亡小體形態(Hoechst 33258)。通過照片觀察出現核凋亡細胞數來進行細胞凋亡率統計，每份數據至少統計400個細胞。DNA ladder通過瓊脂糖凝膠電泳(1.2%)并使用SDNAClear核酸染料染色，凝膠成像系統拍照分析。細胞計數通過Hoechst/PI雙染熒光法來進行測算［5］。細胞數標準曲線制作如下:根據測定5×106到5×103細胞的Hoechst(1.15 mg·L-1)熒光值變化繪制總細胞數標準曲線;根據對同樣數目細胞的溫和裂解后PI(20 mg·L-1)的熒光值變化繪制死亡細胞標準曲線;通過對處理樣品的Hoechst/PI聯合染色的雙熒光吸收標準曲線計算非壞死細胞數。所有計數均在96孔板上(NUNC)完成，37℃恒溫反應30 min后測定。

1.6 氧化還原抑制劑對紫檀芪引起HeLa細胞凋亡的影響 選擇活性氧及GSH的相應抑制劑與調節劑按照 CAT(2 ×105Units·L-1)、BSO(200 μmol·L-1)、NAC(200 μmol·L-1)、Temp(200 μmol·L-1)所標示濃度加入HeLa細胞培養基中，預處理2 h后加入紫檀芪80 μmol·L-1處理48 h測定凋亡率，空白對照為培養2 h后更換培養基繼續培養48 h的HeLa細胞。

1.7 紫檀芪對細胞氧化還原態變化的影響 細胞內氧化還原水平的變化以細胞總活性氧及還原型谷胱甘肽的變化來表示。使用熒光探針(H2DCFDA)(Ex/Em=488 nm/525 nm)來檢測細胞內總活性氧，CMFDA探針檢測還原型谷胱甘肽(Ex/Em=492 nm/517 nm)。收集經不同濃度紫檀芪處理的HeLa細胞，使用終濃度20 μmol·L-1H2DCFDA 或5 μmol·L-1CMFDA 于 37℃ 孵育 30 min，2000 r·min-1離心收集細胞并用PBS洗掉未進入細胞內的熒光探針。無酚紅培養基重懸HeLa細胞，酶標儀檢測熒光光度。MFI表示為每10 000個非壞死細胞對應的熒光吸收。

1.8 紫檀芪對內質網脅迫標志分子的轉錄水平的影響 分別使用CAT(2×105Units·L-1)或NAC(200 μmol·L-1)預處理 HeLa細胞2 h后，加入紫檀芪80 μmol·L-1處理48 h。陽性對照培養2 h后加入DTTox(20 μmol·L-1)處理48 h?？瞻讓φ諡榕囵B2 h后更換培養基繼續培養48 h的HeLa細胞。處理完畢后，所有處理同時測定內質網脅迫相關分子表達情況。本實驗使用相對半定量RT-PCR方法來檢測內質網脅迫標志分子grp78、CHOP的表達變化。使用TRIzol試劑盒提取總RNA。不同處理的細胞樣品RNA通過Revert Aid H Minus反轉錄試劑盒并使用Oligo(dT)18進行cDNA第一鏈合成，42℃延伸60 min。PCR擴增條件為:熱啟動，起始溫度 94℃，3 min;變性 94℃，30 s;復性 58℃，30 s;延伸72℃，45 s;為了使擴增產物量與循環數保持在線性范圍內，我們根據文獻設定了以下引物及對應反應循環數(16-35)［6］。grp78，上游引物:5′-TAG CGT ATG GTG CTG CTG TC-3′，下游引物:5′-TTT GTC AGG GGT CTT TCA CC-3′，擴增循環數 19;CHOP，上游引物:5′-AGC TGA GTC ATT GCC TTT CT-3′，下游引物:5′-CTG GTT CTC CCT TGG TCT TC-3′，擴增循環數32;內標β-actin，上游引物:5′-ATG ATA TCG CCG CGC TCG-3′，下游引物:5′-CGC TCG GTG AGG ATC TTC A-3′，擴增循環數35。PCR產物經瓊脂糖凝膠(1.2%)電泳后，使用SDNAClear核酸染料染色，凝膠成像系統拍照分析。

1.9 統計學處理 所有數據采用SPSS 11.5統計軟件作t檢驗。

2 結果

2.1 紫檀芪對HeLa細胞增殖的影響 不同濃度紫檀芪對HeLa細胞均有一定的增殖抑制作用，這與處理時間和劑量成正相關(Fig 2)。紫檀芪濃度小于20 μmol·L-1時對HeLa細胞抑制率較低，當濃度增加至40～80 μmol·L-1時細胞抑制率呈快速上升趨勢。紫檀芪作用48 h的半數抑制濃度(IC50)為 80 μmol·L-1。而經過長時間(72 h)高濃度紫檀芪(120 μmol·L-1)處理，HeLa細胞近乎全部死亡。據此后續實驗選擇藥物濃度為80 μmol·L-1、處理時間為48 h進行研究。

Fig 2 The inhibitory rate of Pte on HeLa cells after the treatment of 24，48 and 72 hoursHeLa cells were treated with 0 ～ 160 μmol·L-1pterostilbene for time intervials of 24，48 and 72 hours.The cytotoxcity of Pte on HeLa cell was made by SRB assay.The mean viability relative to control was plotted against the Pte concentration.An IC50of Pte on HeLa cells at 48 h is 80 μmol·L-1.The error bars represent the 95% confidence intervals of three independent experiments.

2.2 紫檀芪引起HeLa細胞凋亡 普通光鏡下正常對照組的HeLa細胞成簇平鋪分布，呈不規則菱形，細胞界限清晰(Fig 3A)。紫檀芪處理48 h后，HeLa細胞出現明顯凋亡形態。細胞膜呈現囊泡化特殊結構(Fig 3B，3F)。細胞核DNA經Hochest熒光試劑染色后，空白對照組細胞核呈圓形(Fig 3C)，藥物處理組則表現出核凋亡所特有的不均一化形態(Fig 3D)。通過AO/EB雙染可以看出凋亡是紫檀芪引起HeLa細胞死亡的主要因素(Fig 3E，3F)。經凝膠電泳分析，對照組HeLa細胞DNA沒有片段化，而80 μmol·L-1紫檀芪處理 HeLa細胞 48 h后DNA呈現梯狀片段化，120 μmol·L-1則更加明顯(Fig 3G)。

2.3 紫檀芪對HeLa細胞氧化還原狀態的改變及在凋亡中的作用 為了研究紫檀芪引起HeLa細胞凋亡的原因，本實驗測定了紫檀芪引起HeLa細胞活性氧與還原力(GSH)隨藥物濃度改變而變化的動態關系(Fig 4)。在紫檀芪濃度由5 μmol·L-1至160 μmol·L-1增加過程中，HeLa細胞內活性氧含量也在增加，且當紫檀芪濃度超過80 μmol·L-1后迅速升高。但細胞內GSH含量在紫檀芪濃度低于80 μmol·L-1時，隨著 ROS 的升高而升高;而當紫檀芪濃度超過80 μmol·L-1后，細胞內GSH含量又迅速下降。為了研究GSH水平的劇烈變化是否影響到細胞的凋亡，我們使用了氧化還原反應抑制劑來分析紫檀芪誘導HeLa細胞凋亡過程中對氧化還原態變化的影響。在氧化還原反應抑制劑中，γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS)特異性抑制劑BSO能夠引起細胞凋亡。抗氧化酶及底物過氧化氫酶CAT、GSH合成前體物NAC以及超氧陰離子淬滅劑Tempol均不引起HeLa細胞凋亡。在紫檀芪處理HeLa細胞前通過這些氧化還原抑制劑預處理，我們發現BSO預處理明顯升高了紫檀芪引起HeLa細胞的凋亡率，而CAT和NAC可以抑制紫檀芪所引起的HeLa細胞凋亡。但Tempol預處理對紫檀芪引起HeLa細胞凋亡影響并不明顯(Fig 5)。

Fig 3 Morphological characteristics of HeLa cells and fragmentation of genomic DNA of HeLa cells(magnified 200×)A，C，E:HeLa cells without Pte treatment.B，D，F:HeLa cells treated with 80 μmol·L-1Pte for 48h.A and B were photoed by light microscopy to show the morphological changes of HeLa cells.C and D were photoed by fluorescence microscope to show the morphological changes of HeLa cell nucleus.E and F were photoed by fluorescence microscope in term of AO/EB stain to show the differences in apoptosis and necrosis of HeLa cells.G:DNA ladder of HeLa cells were observed after exposed to Pte for 48 h.The left lane:control sample without Pte treatment.The middle lane:sample treated by 80 μmol·L-1Pte.The right lane:sample treated by 120 μmol·L-1Pte.

Fig 4 ROS generation and GSH changes in HeLa cells induced by Pte(magnified 200×)

2.4 紫檀芪對內質網脅迫標志分子的轉錄水平的影響 如Fig 6所示，紫檀芪誘導HeLa細胞凋亡過程中，內質網脅迫是其凋亡的主要原因之一。隨著紫檀芪濃度增大，grp78及CHOP的表達量均相對于對照明顯增加，甚至超過陽性對照(DTTox)所引起的程度(Fig 6)。通過CAT及NAC共處理HeLa細胞，我們發現內質網脅迫分子grp78與CHOP表達量均明顯降低，這與Fig 5中二者能夠抑制紫檀芪引起的HeLa細胞凋亡現象一致。

3 討論

有關紫檀芪的抗腫瘤活性研究較少，僅有少數細胞毒活性研究證實其能夠抑制B16-F10細胞、HL-60細胞的生長［7］。紫檀芪對體外生長的B16-F10細胞的抑制率為40%(40 μmol·L-1)，對體內實體瘤生長抑制率為52%。在前髓系白血病HL-60細胞體外實驗中，紫檀芪引起細胞凋亡的AC50為70 μmol·L-1，而白藜蘆醇的 AC50為 50 μmol·L-1。與HL-60細胞接近，在HeLa細胞上紫檀芪IC50為80 μmol·L-1。已知白藜蘆醇對多株腫瘤細胞的IC50范圍為(32 ～ 100 μmol·L-1)［7-8］。這些證據說明紫檀芪細胞毒活性較白藜蘆醇弱。

Fig 5 Effects of ROS scavengers，GSH modulator on Pte-induced apoptosis in HeLa cells for 48 hPte was used at 80 μmol·L-1.CAT(2 × 105Units·L-1);BSO(200 μmol· L-1);NAC(200 μmol· L-1);Temp(200 μmol·L-1);＊＊P＜0.01 vs the Blank(BLK);##P＜0.01 vs Pte.The results shown representative of three independent experiments(Student’s ttest).

Fig 6 Expression of grp78 and CHOP in different groups detected by semi-quantitative RT-PCRBlank(BLK)，DTT mean positive control of DTTox，CAT+Pte means Pte treatment(80 μmol·L-1)combined with catalase(2 × 105 Units·L-1)，NAC+Pte means Pte treatment(80 μmol·L-1)combined with NAC(200 μmol·L-1).

由于腫瘤細胞生長增殖依賴于細胞內較高水平的活性氧，因此抗腫瘤藥物的研究多集中于細胞活性氧信號對凋亡調控的作用上［9］。近年來人們逐漸對一些抗氧化藥物的實際作用產生質疑:一些非生物系統證實的抗氧化藥物在生物系統內表現為助氧化［1］。目前尚沒有足夠的證據證明紫檀芪的氧化/還原性。我們發現當紫檀芪引起HeLa細胞活性氧升高時，GSH也在一定范圍內的增加。這表明經紫檀芪處理后，HeLa細胞能在一定程度維持胞內氧化還原狀態的穩定，此過程可能與細胞抗氧化應答元件的如Nrf-2/ARE調控有關［10］。如果不考慮熒光探針的檢測效率，從數量級上我們可以看出HeLa細胞內GSH的主導地位，這與其它的報道是一致的［11］。谷胱甘肽是細胞中所有還原物質中含量最高的(約1～10 mmol·L-1)，其變化可能對細胞正常生長具有較大的影響。細胞質中GSSG∶GSH約為1∶100，而在內質網中，GSSG∶GSH約為1∶3。這使得當細胞內氧化還原態受到藥物影響而改變時，內質網對GSH的變化表現尤為敏感［12］。同時也提示了當紫檀芪濃度超過80 μmol·L-1后細胞的凋亡率迅速升高的原因。紫檀芪引起內質網脅迫分子grp78與CHOP表達量增加，說明在凋亡過程中內質網發生了應激反應。而通過CAT和NAC來抑制細胞內H2O2的產生并促進GSH的生成時，內質網應激反應標志分子表達減弱。這說明了內質網在紫檀芪誘導HeLa細胞凋亡過程中可能擔當了重要的角色。當通過這些抗氧化劑進行預處理時，清除細胞內H2O2或增加GSH的含量均可抑制凋亡的產生，而清除O-·2卻不能抑制凋亡，進一步說明細胞內H2O2/GSH的失衡可能在紫檀芪誘導凋亡過程中承擔重要角色。

綜上所述，紫檀芪能抑制HeLa細胞增殖，并誘導其凋亡。紫檀芪通過影響細胞內的氧化還原平衡穩態進而引發內質網脅迫最終導致凋亡的發生。本研究直接將細胞內氧化還原水平變化與內質網凋亡途徑聯系起來，并探討了紫檀芪誘導HeLa細胞凋亡可能的機制，為腫瘤的治療及新藥開發提供理論依據。

［1］Virgili F，Marino M.Regulation of celluar signals from nutritional molecules:a specific role for phytochemicals，beyond antioxidant activity［J］.Free Radic Biol Med，2008，45(9):1205-16.

［2］Athar M，Back J H，Tang X，et al.Resveratrol:A review of preclinical studies for human cancer prevention［J］.Toxicol Appl Pharm，2007，224(3):274-83.

［3］Ferrer P，Asensi M，Segarra R，et al.Association between pterostilbene and quercetin inhibits metastatic activity of B16 melanoma［J］.Neoplasia，2005，7(1):37-47.

［4］Skehan P，Storeng R，Scudiero D，et al.New colorimetric cytotoxicity assay for an ticancer-drug screening［J］.J Natl Cancer I，1990，82(13):1107-12.

［5］Tonary A M，Pezacki J P.Simultaneous quantitative measurement of luciferase reporter activity and cell number in two-and three-dimensional cultures of hepatitis C virus replicons［J］.Anal Biochem，2006，350(2):239-48.

［6］Kuang E S，Wan Q W，Li X J，et al.ER stress triggers apoptosis induced by Nogo-B/ASY overexpression［J］.Exp Cell Res，2006，312(11):1983-8.

［7］Roupe K A，Remsberg C M，Yá?e Z，et al.Pharmacometrics of stilbenes:seguing towards the clinic［J］.Curr Clin Pharmacol，2006，1(1):80-101.

［8］Surh Y J，Hurh Y J，Kang J Y，et al.Resveratrol，an antioxidant presnt in red wine，induces apoptosis in human promyelocytic leukemia(HL-60)cells［J］.Cancer Lett，1999，140(1-2):1-10.

［9］余妙容，郭坤元，牛新清，等.氧化還原狀態的改變控制手霉素誘導HL-60白血病細胞凋亡［J］.中國藥理學通報，2008，24(6):772-7.

［9］She M R，Guo K Y，Niu X Q，et al.Redox control of manumycininduced apoptosis in HL-60 leukemia cells［J］.Chin Pharmacol Bull，2008，24(6):772-7.

［10］Frohlich D A，McCabe M T，Arnold R S，Day M L.The role of Nrf2 in increased reactive oxygen species and DNA damage in prostate tumorigenesis［J］.Oncogene，2008，27(31):4353-62.

［11］Bánhegyi G，Benedetti A，Csala M，Mandl J.Stress on redox［J］.FEBS Lett，2007，581(19):3634-40.

［12］Hwang C，Sinskey A J，Lodish H F.Oxidized redox state of gultathione in the endoplasmic reticulum［J］.Science，1992，257(5076):1496-502.