雌激素對慢性內臟痛雌鼠的敏化作用及其機制

陳 瑜，唐 影，焦海霞，林 春

腸易激綜合征(irritable bowel syndrome，IBS)為女性易罹患的以反復腹痛與胃腸功能改變為特征的臨床常見病［1］。據報道［2－4］女性患病率為男性的2～3倍，而且在圍月經期癥狀加重，藥物或手術去除月經周期后可減輕癥狀。我們前期的研究表明［5］IBS模型雌鼠內臟痛覺較模型雄鼠敏感，且與其血清雌激素水平正相關。雌激素受體分布于中樞和外周神經系統中許多與痛覺有關的區域中［6］。有報道［7］，在急性內臟痛的動物模型上，雌激素受體和NMDA受體的NR1亞單位共表達，NMDA受體的激活在痛覺過敏以及異常痛的產生和維持中發揮著重要作用。那么，在以慢性內臟痛為特征的IBS中，雌激素與NMDA受體有無關系呢?它是否通過改變NMDA受體的功能從而影響內臟痛呢?因此，本研究觀察比較了雌激素水平對IBS模型雌鼠內臟高敏感性的影響，同時使用D(-)-2-amino-5-phosphonopentanoic acid(AP-5，NMDA受體阻斷劑)脊髓內給藥的方法，比較高、低雌激素組IBS模型大鼠鎮痛作用的差異。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 新生♀ SD大鼠，購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司［實驗動物許可證號:SCXK(滬)2007-0005，動物實驗室許可證號:SYXK(閩)2004-0007］。大鼠自由飲食，自然光照，模型組在出生后8～15 d接受結直腸擴張(CRD)刺激，然后飼養至8周后開始各項實驗。實驗前18 h動物禁食不禁水。模型制備見后，對照鼠除未進行新生期結直腸擴張刺激外，其余處理同模型鼠。模型組與對照組再各自設立高雌激素組(E2組)與低雌激素組(OVx組)，E2組與OVx組大鼠均去卵巢，E2組大鼠在測量內臟痛前2 d腹腔注射雌激素100 μg(溶于 200 μl紅花油)［7］，OVx 組大鼠則不補充雌激素。

1.2 實驗材料 異戊巴比妥鈉、β-Estradiol 3-benzoate(Sigma No.E8875)，Ap-5(Sigma No.E8054)，紅花油，生理鹽水，乙醚，頭孢曲松鈉。

人血管重建氣囊20 mm×2.5 mm(美國)，RM6240多道生理記錄儀(成都儀器廠)，針形電極，血壓計，自制結直腸加壓氣囊。

1.3 大鼠腸易激綜合征模型［8］4窩模型鼠在出生后8～15 d，每天接受一次CRD刺激。將人血管重建氣囊全部插入幼鼠結直腸中，充氣擴張產生60 mmHg壓力，維持l min后放氣撤出，此后正常飼養至成年。模型鼠13只，其中高雌激素組6只，低雌激素組7只。對照鼠共14只，其中高、低雌激素組各7只。

1.4 腹外斜肌放電測量 安靜且室溫24℃ ～26℃條件下，依據Morteau等［9］的方法，將雙極電極固定于大鼠腹外斜肌上，用RM6240多道生物信號采集處理系統記錄大鼠腹外斜肌放電活動(參數設置:高頻濾波3 kHz，時間常數0.001 s，采樣頻率為20 kHz，靈敏度 200 μV，走紙速度 200 ms/div)。大鼠清醒后適應30 min，首先記錄其腹外斜肌基礎放電，然后通過加壓氣囊對大鼠結直腸予以CRD(壓力為20、40、60、80 mmHg，持續 10 s，間隔 4 min)，記錄其在不同壓力下的腹外斜肌放電。

1.5 鞘內插管 異戊巴比妥鈉麻醉，大鼠自然俯臥，剪毛，消毒。在大鼠背部髂腰脊連線之中點稍下方摸到第6腰椎間隙，以其為中心做背部正中縱切口。取18 cm的PE-10聚乙烯管，在一端3 cm處用油性筆做標記，穿入9號針筒的針頭內。針頭沿兩個椎體間隙插入椎管，見大鼠有甩尾現象時應停止進針，向前推送PE-10聚乙烯管2～3.5 cm，即到達脊髓L6～S2節段。退出針頭，使PE-10聚乙烯管留在椎管中，固定插管。將插管另一端經皮下由大鼠項部穿出，并固定在項部，保持其直立。每只大鼠腹腔注射頭孢曲松鈉0.25 g(溶于1 ml生理鹽水)，預防術后感染。

1.6 大鼠去卵巢術 異戊巴比妥鈉麻醉，大鼠仰臥位固定，下腹正中2 cm切口，延腹白線切開肌肉層，打開腹腔，于下腹部找到兩側輸卵管，沿輸卵管找到兩側卵巢，于卵巢下方結扎輸卵管，再切除卵巢。分別縫合腹肌及腹部皮膚。

1.7 AP-5鞘內給藥并記錄其抑制效應 在大鼠去卵巢術后的10～20 d，先按前述方法測定大鼠對80 mmHg CRD刺激的腹外斜肌放電。乙醚麻醉后，用微量加樣器向椎管內注入AP-5 100 nmol(溶于10 μl生理鹽水)，并用5 μl生理鹽水將殘留藥物沖入椎管內。分別在給藥后5、10、15、30 min測定大鼠對80 mmHg CRD刺激的腹外斜肌放電反應，并計算其抑制百分比［7］。計算方法如下:抑制百分比 =(給藥前的放電－給藥后的放電)/給藥前的放電×100%。

2 實驗結果

2.1 高雌激素模型鼠的腹外斜肌放電水平高于低雌激素模型鼠 在20 mmHg的CRD壓力下，高雌激素模型鼠的腹外斜肌放電水平高于低雌激素模型鼠，兩組差別有顯著性(P＜0.05)，在40～80 mmHg的CRD壓力下，差別均無顯著性(Fig 1);然而高、低雌激素對照鼠在各個水平的CRD壓力下腹外斜肌放電水平差別均無顯著性。

2.2 AP-5的抑制作用在高、低雌激素模型鼠之間無明顯差別 AP-5的抑制作用在5 min時最強，隨時間延長漸漸減弱。在高雌激素模型鼠與低雌激素模型鼠3個給藥時間點(5、10、15 min)，腹外斜肌放電反應程度均低于給藥前，P值均＜0.05(Fig 2)。模型鼠高、低雌激素兩組之間在AP-5給藥5～30 min內，抑制百分比的差別無顯著性(P＞0.05)，說明雌激素水平高低對NMDA受體的功能沒有明顯影響。

Fig 1 Comparism of electric discharge of EOMA between high estrogen and OVx model rats*P＜0.05 vs the OVx model rats

Fig 2 The inhibited effect by intrathecal administration of AP-5 on OVx and E2 model ratsB:before AP-5 administration;A5:5 minutes after AP-5 administration;A10:10 minutes after AP-5 administration;A15:15 minutes after AP-5 administration;A30:30 minutes after AP-5 administration.*P ＜0.05 vs the OVx B;#P＜0.05 vs the E2 B

3 討論

本研究顯示高雌激素模型鼠的內臟痛較低雌激素模型鼠敏感，說明雌激素對IBS模型鼠慢性內臟痛覺敏化具有促進作用，這與我們以往的研究結果一致［5］。而高雌激素與低雌激素對照鼠之間的內臟痛沒有明顯差別，說明高雌激素可造成模型鼠內臟痛高敏，卻不能引發對照鼠的內臟痛高敏。這提示模型雌鼠可能存在雌激素引發內臟痛敏化的機制。

研究發現［10］在胃腸道和腦－腸軸都有雌激素受體分布。早期Papka等［11］用原位雜交技術發現在背根神經節感覺神經元、迷走神經和交感神經的感覺纖維、盆神經節的副交感神經元都有雌激素α和β受體的mRNA轉錄，近年又有證據顯示［12］雌激素影響軀體和內臟感覺傳遞。究竟雌激素是通過何種途徑影響軀體和內臟感覺傳遞的?Tang等［7］在急性內臟痛研究中發現，鞘內給予NMDA受體拮抗劑AP-5，能減輕內臟運動反應，其程度在低雌激素大鼠大于高雌激素大鼠，提示雌激素可能通過激活脊髓中NMDA受體的功能，增加大鼠的內臟痛敏感性。

谷氨酸為腦和脊髓內主要的興奮性神經遞質，NMDA受體為興奮性氨基酸受體的一種，興奮性神經遞質通過各種膜門控離子通道產生突觸后效應。NR1和NR2亞單位的不同組合決定了NMDA受體特定通道的活性。NR1是NMDA受體通道活性所必須的，而NR2具有調節通道活性的作用。NMDA受體在脊髓中主要存在于背角。脊髓過度興奮和持久疼痛的發生涉及NMDA受體功能活化，NMDA受體功能增強和通道開放率直接有關［13］。NMDA受體NR2B亞單位可能參與慢性內臟痛外周與脊髓痛覺敏感的過程［14］性激素可通過調節谷氨酸受體表達或翻譯后修飾，改變腦內谷氨酸受體傳遞［15］。有研究表明［16］雌激素增加了NMDA受體介導的下丘腦神經元興奮。然而本研究結果表明，在慢性內臟高敏的大鼠鞘內給予NMDA受體拮抗劑AP-5，可減輕內臟運動反應，且在低雌激素大鼠與高雌激素大鼠之間差異無顯著性，與Tang等研究結果不同。這可能是由于慢性內臟痛的發病機制與急性內臟痛的發病機制不同所致(Tang等［7］研究所用的是急性內臟痛模型)。谷氨酸受體可分為NMDA受體、AMPA受體和KA受體、代謝型谷氨酸受體和L-AP4受體等。有報道［16］體內非 NMDA受體可能參與介導IBS慢性內臟痛敏，因此我們推測，雌激素調節脊髓NMDA受體功能可能不是慢性內臟痛覺敏化的主要因素。總之，在慢性內臟高敏大鼠中，雌激素促進慢性內臟高敏的機制尚有待進一步研究。

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