山葡萄素抗動脈粥樣硬化分子機制研究

李韶菁，黃 峰，藍 希，杜冠華

心腦血管疾病是現今危害人體健康和生命最嚴重的病癥之一，具有高發病率、高致殘率和高死亡率，是中老年人常見病和多發病。而動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是心腦血管病的主要病理基礎。

目前認為AS病因相對復雜，是由多種危險因子相互關聯，共同作用的結果。并且AS的病理改變也是一種慢性炎癥性反應［1-2］，涉及多種炎性細胞因子、自由基、生長因子、黏附分子等一系列活性分子，而ox-LDL在AS發生早期是最重要的致病因子［3］。來源于山葡萄籽提取物中的白藜蘆醇具有廣泛的藥理活性作用，有報道其四聚體山葡萄素A(vitisin A)和 7′′′-8′′′-二脫氫山葡萄素 A(7′′′-8′′′-didehydro-vitisin A)，具有一定的心、腦血管保護作用［4］，但對其抗AS作用研究仍較少，分子機制尚不明確。本研究采用ox-LDL和LPS損傷，擬從體外角度通過檢測損傷后內皮細胞和巨噬細胞活力，脂質過氧化產物MDA的含量和SOD活性、活性氧和NO產生，巨噬細胞炎性細胞因子釋放，單核細胞和內皮細胞黏附等涉及AS發生早期的多個關鍵環節，探討其抗動脈粥樣硬化可能涉及的分子機制。

1 材料與方法

1.1 藥品與主要試劑 Hoescht 33258，Invitrogen;佛波酯(phorbomyristateacetate，PMA)、脂多糖(lipopolysaccharides，LPS)、四氮唑藍(nitroblue tetrazolium，MTT)，2′-7′-二氯熒光素雙醋酸鹽(2′，7′-dichlorofluorescin diacetate，DCFH-DA)，Sigma 公司;ox-LDL，中國醫學科學院基礎研究所;一氧化氮，MDA，SOD測定試劑盒，南京建成生物工程研究所;乳酸脫氫酶測定試劑盒，北京北化康泰臨床試劑有限公司;鼠源 IL-1β、TNFa酶聯免疫測定試劑盒，eBioscience公司，USA;人源IL-1β酶聯免疫測定試劑盒，武漢博士德;DMEM高糖、RPMI 1640培養基和胎牛血清，Gibco。

1.2 主要儀器和設備 Spectra Max M5酶標儀，Molecular Devices，USA;熒光倒置顯微鏡(Olympus，Tokyo，Japan)。

1.3 細胞 單核細胞源性巨噬細胞THP-1，人內皮細胞Hy926細胞株由中國醫學科學院國家藥物篩選中心保存;鼠巨噬細胞RAM246.7細胞株，人正常肝細胞株L02購自上海細胞所。

1.4 溶液配制

1.4.1 待測化合物配置 山葡萄素A和二脫氫山葡萄素A［5-6］(以下簡稱為vsA和ddh-vsA)由中國醫學科學院藥物研究所天然藥物化學室林茂老師提供，將二者均用DMSO配置成10 mmol·L-1儲存液，工作液從終濃度100 μmol·L-1始3倍稀釋8個濃度。

1.4.2 熒光染料DCFH-DA的配制 熒光染料DCFH-DA配置成10 mmol·L-1的 DMSO儲液，加入細胞培養液使終濃度為20 μmol·L-1。

1.4.3 熒光染料Hoescht33258的配制 熒光染料Hoescht 33258用無菌培養液配成10 mmol·L-1儲液，加入細胞培養液使終濃度為1 μmol·L-1使用。

1.5 實驗方法

1.5.1 酶聯免疫法(ELISA)測定巨噬細胞IL-1β(或TNF-α)的分泌 在24孔板中，每孔含有約2.0×108·L-1鼠巨噬細胞或經160 nmol·L-1PMA誘導分化48 h的THP-1巨噬細胞，加入陽性對照藥物TO901317和待測藥物，同時設置空白對照孔，預孵育30 min，加入脂多糖LPS(終濃度為1 mg·L-1)，孵育24 h，取上清100 μl，檢測采用ELISA試劑盒進行。

1.5.2 一氧化氮含量測定 THP-1細胞按照2×104的細胞數加入48孔板，PMA誘導分化，待細胞貼壁后，分為空白組、ox-LDL組(ox-LDL終濃度100 mg·L-1)、ox-LDL+樣品組，各組設置4個復孔，處理24 h取各組細胞培養上清100 μl，按照測試盒操作說明檢測NO的濃度。

1.5.3 ox-LDL致細胞損傷后MTT法和乳酸脫氫酶(LDH)法細胞活力測定 將培養好的Hy926細胞和PMA誘導的THP-1細胞，以每孔約為5×103細胞數鋪96孔板，加入不同稀釋濃度的測試樣品孵育30 min后，再加入 ox-LDL，分別孵育 12、24、48 h后，加入 100 μl MTT，按文獻方法［7］進行 MTT 細胞活力測定或取細胞上清按照北京北化康泰試劑盒方法測定乳酸脫氫酶活性。

1.5.4 MDA和SOD的測定 將24孔培養的細胞分為空白組和樣品處理組，加入樣品后預孵育30 min，加入ox-LDL培養2 d，收集細胞。細胞裂解液裂解細胞，Lowry法蛋白定量，分別按照試劑盒操作說明測定細胞中的MDA含量和SOD活性。

1.5.5 細胞活性氧的熒光檢測方法 將培養的巨噬細胞分為空白組、陽性對照組和樣品處理組，先加入樣品預孵育30 min后，加入ox-LDL處理培養2 d后，用20 μmol·L-1活性氧特異熒光探針 DCFHDA處理30 min。通過Spectra Max M5酶標儀檢測熒光強度評價細胞內ROS水平(Ex=485 nm，Em=530 nm)。

1.5.6 單核細胞THP-1和內皮細胞Hy926黏附實驗［8-9］將長至對數生長期的Hy926細胞以5×108·L-1接種于96孔板，待細胞融合80% ～100%，加入含ox-LDL的培養基(含2%BSA，0.5%FBS)，作用24 h。另外，取對數生長期THP-1細胞，控制細胞濃度2～5×109·L-1，加入終濃度為10 mg·L-1細胞核特異熒光染料Hoechst 33258，避光，培養30 min，無血清培養基洗后，1 000 r·min-1離心制備濃度為1×109·L-1的THP-1細胞懸液，加入已鋪好Hy926細胞的96孔培養板中，每孔50 μl。避光培養60 min。棄上清，加入PBS，輕輕振蕩，去除未黏附細胞。于倒置熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.6 研究用化合物結構 見Fig 1A，1B。

Fig 1 Chemical Structure of two compoundsA:7?-8?-didehydro-vitisin A;B:vitisin A

2 結果

2.1 MTT法檢測4個化合物細胞毒結果 檢測化合物vsA和ddh-vsA對Hy926、PMA誘導的THP-1巨噬細胞和RAW264.7的細胞毒作用，結果顯示除化合物vsA對RAW264.7細胞在100 μmol·L-1顯示輕微細胞毒作用外，其余均未顯示明顯毒性作用(詳細結果和具體方法略)

2.2 化合物對ox-LDL致巨噬細胞和內皮細胞氧化損傷的保護作用 實驗結果如Fig 2～4顯示，ox-LDL可明顯導致人單核細胞源性巨噬細胞THP-1、鼠巨噬細胞RAW264.7和內皮細Hy926活力下降和LDH的釋放增加。化合物vsA和ddh-vsA可明顯增加ox-LDL損傷后內皮細胞活力(MTT還原法);并可明顯降低不同孵育時間下的LDH釋放并呈一定的濃度依賴關系。兩種方法檢測結果基本一致，提示兩個被測化合物均起到一定的內皮細胞保護作用。

2.3 化合物對LPS誘導的TNF-α和IL-1β分泌的影響 利用ELISA方法考察LPS刺激巨噬細胞后，活性化合物對TNF-α和IL-1β分泌水平的影響。結果如Fig 5，6所示，活性化合物對人和鼠巨噬細胞TNF-α、IL-1β的分泌有非常好的抑制作用，并且呈很好的濃度依賴關系，表明化合物具有較好的抗炎作用。

2.4 化合物對巨噬細胞產生一氧化氮產生的抑制作用 以ox-LDL為炎癥誘導因子，研究化合物對ox-LDL處理后的巨噬細胞產生NO是否存在抑制作用。結果如Fig 7所示，化合物對巨噬細胞NO的產生具有較強的抑制作用，而且有很好的劑量依賴關系。

Fig 2 Effect of compounds on ox-LDL induced alternation of cell viability in Hy926(48 h，MTT assay) ± s，n=4)C:Control;O:ox-LDL treated model group;T:1 μmol· L-1 TO901317 treated.＊＊P ＜0.01 vs control;#P ＜0.05，##P ＜0.01 vs ox-LDL

Fig 3 Effects of vsA(A)and ddh-vsA(B)on ox-LDL induced alteration of LDH release in Hy926(±s，n=4)T:1 μmol·L-1TO901317 treated，vsA and ddh-vsA:3，10，30 μmol·L-1treated.＊＊P ＜0.01 vs control;#P ＜0.05，##P＜0.01 vs ox-LDL treated

Fig 4 Effects of compounds on ox-LDL induced alteration of LDH release in mouse macrophage cell line RAW264.7(A)and PMA-induced human macrophage cell line THP-1(B)(±s，n=4)T:1 μmol·L-1TO901317 treated;vsA and ddh-vsA:3，10，30 μmol·L-1treated.＊＊P ＜0.01 vs control;#P ＜0.05，##P＜0.01 vs ox-LDL treated

Fig 5 The inhibitory effect of compounds on LPS-induced IL-1β secretion in mouse macrophage(±s，n=4)C:Control;T:1 μmol·L-1TO901317 treated;vsA and ddh-vsA:3，10，30 μmol·L-1treated. ＊＊P ＜ 0.01 vs control;#P ＜ 0.05，##P ＜0.01 vs LPS treated

Fig 6 The inhibitory effect of compounds on LPS induced TNF-α secretion in human macrophage THP-1(A)and mouse macrophage RAW264.7(B)(±s，n=4)C:Control;LPS:Model LPS treated T:1 μmol·L-1TO901317 treated;vsA and ddh-vsA:3，10，30 μmol·L-1treated.＊＊P ＜ 0.01 vs control;#P ＜0.05，##P ＜0.01 vs LPS treated

2.5 化合物抑制細胞活性氧生成的作用 鑒于氧化應激在動脈粥樣硬化中的關鍵作用，我們探討了化合物對ox-LDL處理的內皮細胞和巨噬細胞中活性氧生成的影響。結果如Fig 8，9，活性化合物vsA和ddh-vsA均可降低ox-LDL致RAW264.7和Hy926細胞中活性氧的釋放，提示化合物具有抑制細胞ROS生成的作用，并具有一定的濃度依賴關系。

2.6 化合物抑制ox-LDL致MDA生成增加和誘導SOD表達的作用 本實驗通過檢測體外培養Hy926和RAW264.7中MDA的含量來反映化合物對脂質過氧化損傷的影響，結果如Fig 10所示，活性化合物均可以減少Hy926細胞中MDA的含量，誘導SOD的表達，提示對過氧化脂質產生的損傷可能有保護作用。

Fig 7 The inhibitory Effect of compounds on ox-LDL induced NO release in macrophage THP-1(24 h)(±s，n=4)C:Control;T:1 μmol·L-1TO901317 treated;vsA and ddh-vsA:3，10，30 μmol·L-1treated.＊＊P ＜ 0.01 vs control，#P ＜ 0.05，##P ＜0.01 vs ox-LDL treated

Fig 8 The inhibitory effect of compounds on ox-LDL induced ROS production in mouse RAW264.7(±s，n=4)C:Control;TO901317:0.1，1，10 μmol·L-1treated;vsA and ddhvsA:10，30 μmol·L-1treated;＊＊P ＜ 0.01 vs control，#P ＜ 0.05，##P＜0.01 vs ox-LDL treated

2.7 白藜蘆醇抑制單核巨噬細胞THP-1和內皮細胞Hy926黏附 考察了化合物ddh-vsA對ox-LDL誘導的THP-1和Hy926黏附的影響，結果如Fig 12所示，10 μmol·L-1化合物 ddh-vsA 具有抑制單核細胞和內皮細胞黏附的作用。

3 討論

動脈粥樣硬化實質也是一個包括炎性細胞激活和浸潤的慢性炎癥性疾病［12］，涉及多種細胞因子、生長因子、氧、氮自由基和黏附分子等一系列活性分子。如在激活的巨噬細胞中通過核因子NF-κB(nuclear factor-κB)及活性蛋白-1(activation protein，AP-1)信號傳遞，造成IL-1β、IL-6及TNF-α等多種炎癥細胞因子大量分泌［12，13］。

Fig 9 The inhibitory effect of compounds on ox-LDL induced ROS production in human Hy926(±s，n=4)C:Control;T:1 μmol·L-1TO901317 treated;vsA and ddh-vsA;3，10，30 μmol·L-1treated.＊＊P ＜ 0.01 vs control;#P ＜ 0.05，##P ＜0.01 vs ox-LDL treated

Fig 10 The inhibitory effect of compounds on ox-LDL induced MDA production in Hy926(A)and RAW264.7(B) ± s，n=4)C:Control;T:1 μmol·L-1TO901317 treated;vsA and ddh-vsA:3，10，30 μmol·L-1treated.＊＊P ＜ 0.01 vs control;#P ＜ 0.05，##P ＜0.01 vs.ox-LDL treated.

Fig 11 The effect of compounds on increasing SOD activity in mouse macrophage RAW264.7(±s，n=4)C:Control;TO901317:0.1，1，10 μmol·L-1treated;vsA and ddhvsA:30，10，3 μmol·L-1treated;＊＊ P ＜ 0.01 vs control;#P ＜ 0.05，##P＜0.01 vs ox-LDL treated

Fig 12 The inhibitory effect of 10207 on ox-LDL induced adhesion of THP-1 monocytes to the human endothelial cell line Hy926A:Normal cell;B:ox-LDL 50 mg·L-1treated;C:10 μmol·L-1 ddh-vsA pretreated 30 min before ox-LDL treated

一氧化氮(NO)也是一種具有多種生理功能的小分子物質，病理狀態下大量的NO與超氧陰離子結合形成危害性極大的氮氧自由基，促進AS早期炎癥性細胞和泡沫化細胞的形成［14］。

Ox-LDL具有明顯的致動脈粥樣硬化作用，影響AS病變發生和發展的多個過程［15］。如ox-LDL引發機體產生氧自由基，攻擊生物膜形成脂質過氧化物，如醛類過氧化物丙二醛(MDA)，造成細胞代謝和功能障礙，進一步加重細胞損傷。因此檢測MDA含量可反映細胞內脂質過氧化的程度。

鑒于內皮細胞的損傷和功能改變是動脈粥樣硬化早期的標志性病理事件，保護內皮完整性對預防動脈粥樣硬化具有重要意義。ox-LDL在AS形成的早期起到類似于炎癥介質的作用，可損傷血管內皮，引起細胞內脂質聚集;促進單核細胞向內皮黏附并向內皮下轉移;使內皮細胞對LDL的通透性增高，誘導細胞凋亡，甚至壞死［16-17］。

氧化應激(oxidative stress)與動脈粥樣硬化的發病關系也極為密切。氧化應激產生過量的氧自由基(oxygen free radical，OFR)或活性氧(ROS)造成細胞內脂質聚集，是動脈粥樣硬化發生的一個重要促進因素［12-13］。而超氧歧化酶(SOD)是活性氧清除系統中發揮抗氧化作用的關鍵酶，在保護細胞免受氧化損傷過程中具有十分重要的作用［18］。

文獻報道，核受體LXRs激動劑，TO901317具有明確的早期保護動脈粥樣硬化的作用［19-20］，主要表現在保護內皮細胞完整性、抑制巨噬細胞泡沫化、下調炎性相關基因，抑制炎性細胞因子和活性氧、氮自由基的表達，抑制黏附分子和單核趨化蛋白的表達，減輕炎性細胞因子誘導的單核細胞和內皮細胞黏附等，本文將其作為陽性對照藥物。通過體外培養Hy926、RAM264.7和PMA誘導的THP-1三種細胞，加入損傷因素ox-LDL處理后，(1)采用了MTT法和LDH活性測定兩種方法來檢測細胞活力，評價了化合物對不同孵育時間下ox-LDL致細胞損傷的保護作用。實驗結果表明山葡萄素A和二脫氫山葡萄素A對ox-LDL導致的內皮細胞和巨噬細胞損傷有較明顯的保護作用;(2)通過檢測說明山葡萄素A和二脫氫山葡萄素A可抗氧化，減少氧、氮自由基產生，抑制LPS所致的巨噬細胞炎性因子釋放，抑制ox-LDL導致的單核細胞和內皮細胞黏附。因此，從體外實驗充分證明了山葡萄素A和二脫氫山葡萄素A對以上AS發生早期事件的多個關鍵環節均有作用，對解釋其抗As的分子機制具有重要意義，提示其可能的As保護機制涉及多個靶點和通路的相互作用和調節。

細胞泡沫化途徑及關鍵調控因素，已成為防治AS的重要藥物作用靶點。我國地域遼闊，植物中蘊含豐富的心血管保護成分，提取和篩選其中抗AS有效成份［21］并闡明其機制，是我國藥學研究中一個有發展前途的研究方向。

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