PTEN抑制劑對大鼠內毒素性急性肺損傷的保護作用

葛東建，劉功儉

急性肺損傷(acute lung injury，ALI)和急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)是由多種炎性介質及效應細胞共同參與，并呈級聯放大的瀑布樣炎癥繼發性損傷與繼發性彌漫性肺實質損傷［1］，是臨床常見的呼吸系統急危重癥。由于ALI/ARDS病因與發病機制的復雜性，近年來盡管進行了大量的研究，但其病死率仍居高不下。

PI3K/Akt信號轉導通路是一個促進細胞生長、存活、分化的信號通路。有研究證實［3］激活該信號通路，能保護氧化應激狀態下的肺上皮細胞［2］和抑制肺上皮細胞凋亡。但PI3K/Akt在內毒素(LPS)誘導的ALI中的作用還不十分清楚。PTEN蛋白(Phosphatase and tensin homologue deleted on chromosome ten)是PI3K/Akt通路主要的負性調節器，通過磷脂酶活性使PIP3脫磷酸，抑制PI3K/Akt信號通路［4］。phen是PTEN的特異性抑制劑，目前已被廣泛的應用于科學研究。本文通過研究phen對ALI中Akt活化的影響來探討其在LPS誘導ALI中的作用及可能機制。

1 材料與方法

1.1 動物 成年♂ SD大鼠，體質量230～250 g，購自中國科學院上海實驗動物中心。

1.2 試劑 LPS(E coli，055:B5)購自 Sigma(St Louis，MO)。Bpv(phen)購自 Alexis。抗 Akt抗體(sc-9272)、抗p-Akt(sc-9271)抗體均購自 Cell Signaling。TNF-α和IL-6酶聯免疫試劑盒購自武漢博士德。

1.3 模型制備和分組 取32只大鼠，隨機分為兩組:LPS組和phen+LPS組(n=16)，比較了兩組大鼠48 h的累計死亡率。

另取60只大鼠被隨機分為4組:對照組(control組，n=6)，僅注射等體積的生理鹽水;LPS組(n=24)，經尾靜脈注射LPS 5mg·kg-1;phen+LPS組(n=24)，在注射 LPS前1 h腹腔注射 phen 1.6 μmol·kg-1;phen 組(n=6)，腹腔注射 phen 1.6 μmol·kg-1，1 h后經尾靜脈注射生理鹽水。本實驗中所選擇的藥物劑量以及給藥方式是參照文獻［5］以及我們的預實驗結果。

實驗動物在各時間點，麻醉狀態下經腹主動脈放血處死。開胸暴露兩肺。取出右肺中葉，迅速凍存于液氮中以備勻漿。取右肺下葉，浸泡于10%中性甲醛溶液中固定，然后用石蠟包埋制成蠟塊，5 μm厚連續石蠟切片，HE染色，在光鏡下觀察肺組織的病理學變化。取右肺上葉，稱濕重，然后置于80℃烘箱中烘烤直至恒重再稱重，計算肺濕干重比(W/D)。結扎右肺門，用5ml預冷的PBS分3次灌洗左肺。回收率達到90%。回收的支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolarlavage fluid，BALF)儲存在 -80℃以備檢測蛋白和細胞因子濃度。BALF中的蛋白濃度測定采用BCA法(Bicinchoninic acid)。TNF-α和IL-6的濃度測定采用雙抗體夾心酶聯免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)。

1.4 蛋白質印跡分析(Western blot)參照文獻［6］，提取組織的胞質蛋白。用BCA法測定蛋白濃度，然后保存于-80℃待用。

蛋白樣本加入4倍的上樣緩沖液，煮沸5 min。等量蛋白樣品經12%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離后，以半干轉法電轉移至硝酸纖維素膜上。轉移后的硝酸纖維素膜經3%牛血清白蛋白室溫封閉2 h后，分別加入下列一抗4℃過夜:抗Akt抗體(1∶1 000)、抗p-Akt抗體(1∶500)。用Tris緩沖液吐溫-20(TBST)洗膜3遍，然后用相應的堿性磷酸酶標記的二抗室溫孵育2 h，最后用NBT/BCIP(Promega，上海)顯色。掃描結果用圖像分析儀(LabWorks Software，UVP Upland，CA，USA)處理，數據進行半定量分析。

2 結果

2.1 phen對LPS導致的死亡率的影響 LPS組，大鼠48 h死亡率高達56.3%(共死亡9只)。而phen+LPS組，大鼠48 h死亡率僅有18.8%(共死亡3只)，明顯低于LPS組(P＜0.05)，見Fig 1。

Fig 1 phen，PTEN inhibitor，suppresses LPS-induced mortality For the phen+LPS group，rats were injected with phen(1.6 μmol·kg-1，ip)1 hour before LPS(5 mg·kg-1，iv)treatment.P ＜ 0.05 for phen+LPS group(n=16)vs LPS group(n=16)

2.2 BALF中蛋白濃度的變化 LPS組，LPS注射后6 h，BALF中的蛋白濃度明顯高于Control組(P＜0.05);在phen+LPS組，BALF中蛋白濃度比LPS組降低(P＜0.05);而單獨注射phen對BALF中的蛋白滲出無影響(Tab 1)。

Tab 1 Effect of phen on protein exudation in BALF and lung wet/dry weight ratio±s，n=6)

Tab 1 Effect of phen on protein exudation in BALF and lung wet/dry weight ratio±s，n=6)

*P＜0.05 vs control group;#P＜0.05 vs LPS group

Group Protein/g·L-1W/D Control 47.59±4.44 4.39±0.27 phen 49.13±5.98 4.45±0.20 LPS 76.12±5.38* 5.57±0.42*phen+LPS 57.53±5.56*# 4.84±0.29*#

2.3 BALF中 TNF-α和 IL-6濃度的變化 LPS組，BALF中的TNF-α濃度明顯升高，注射LPS后3 h達峰值，隨后開始下降;而在phen+LPS組，BALF中TNF-α濃度與 LPS組比較降低(P＜0.05，Fig 2A)。同樣，phen+LPS組BALF中的IL-6濃度也明顯低于LPS組(P＜0.05，Fig 2B)。而在phen組，單獨注射phen對BALF中TNF-α和IL-6的釋放無影響(Fig 2A和2B)。

2.4 肺組織病理變化 注射LPS后6 h肺組織病理切片光鏡觀察，LPS組肺組織結構破壞明顯，肺泡內出血較多，肺泡委陷，伴有大量炎性細胞浸潤，間質明顯水腫(Fig 3B);而phen+LPS組上述表現均有所減輕，僅肺間隔輕度增寬，無明顯出血，少量炎性細胞浸潤(Fig 3C)。圖3A為正常肺組織切片。單獨注射phen，對肺組織結構無影響(Fig 3D)。

2.5 肺濕/干重比值的變化 LPS注射后6 h，肺組織的W/D值明顯高于control組(P＜0.05)。而在相同的時間點，phen抑制了LPS導致的肺W/D值的增加(P＜0.05)，而單獨注射phen的W/D值與control組相比，其差異無統計學意義(P＞0.05)。見Tab 1。

2.6 肺組織中p-Akt的活化 LPS明顯減少胞質中p-Akt含量，在LPS組，注射LPS后p-Akt表達隨時間延長越來越少，到12 h幾乎無表達(Fig 4A);提前注射phen在各時間點均明顯提高p-Akt的表達(Fig 4B)。各組間Akt表達沒有變化(Fig 4A，4B)。

3 討論

急性肺損傷/急性呼吸窘迫綜合征(ALI/ARDS)的發生發展涉及多個信號轉導途徑。以往研究較多的是 NF-κB 和 MAPK 信號轉導通路［7，8］，因為已明確該通路可誘導多種炎性細胞因子的表達。但由于近年來對PI3K/Akt信號轉導通路的關注，人們發現PI3K/Akt信號轉導通路是保護肺上皮細胞和緩解肺部炎癥的重要通路之一［5，9］。

Fig 2 LPS-induced alterations of TNF-α and IL-6 levels in bronchoalveolar lavage fluid(BALF)from rats and the suppression of phen±s)A:The concentrations of TNF-α in BALF at each time point after LPS administration and the suppression of phen pretreatment.B:The concentrations of IL-6 in BALF at each time point after LPS administration and the suppression of phen pretreatment.*P＜0.05 vs control group;#P＜0.05 vs LPS group

Fig 3 Microscopic findings of lung tissues stained with hematoxylin-eosin(HE，×400)Histopathologic examination of the lungs was performed at 6 h after LPS injection.A:Control group;B:LPS group:edematous changes of alveolar walls，swelling of alveolar epithelial cells，and massive polymorphonuclear infiltration were observed;C:phen+LPS group:less damage was observed compared with the LPS group;D:phen group:no differences were observed compared with control group

Fig 4 The expression of p-Akt in cytoplasm of lung tissues(ˉ±s，n=3 or 4)

PTEN是目前發現的第一個具有磷酸酶活性的抑癌基因。其編碼的磷酸酶具有蛋白和脂質磷酸酶活性，PIP2在PI3K的磷酸化作用下生成PIP3，從而介導Akt的活化，PTEN卻可以發揮它的磷脂酶活性使PI3K的脂質產物PIP3的3位脫磷酸，下調由PI3K/Akt通路控制的細胞生長和存活［9］。因此，PI3K和PTEN之間關鍵的平衡對細胞存活有重要的影響。而有資料表明PTEN相對較多的分布于分化初期的人肺上皮細胞［9］。

在本實驗中，在注射LPS之前使用phen特異性抑制PTEN，活化PI3K/Akt信號轉導通路能減輕肺實質損傷。與LPS組相比較，這種對LPS-ALI肺實質的保護導致了存活率的明顯改善。該保護作用還進一步被組織病理學檢查所證實。肺組織HE染色顯示，預先注射phen后，LPS導致的肺組織損傷程度明顯減輕。以上這些均表明，PTEN抑制劑能夠緩解LPS導致的急性肺損傷。

那么，PTEN抑制劑是如何發揮其保護作用的呢?肺泡上皮細胞和毛細血管內皮細胞共同組成重要的屏障，以維持肺組織穩定和肺泡最佳的氣體交換，并限制肺泡內液體滲出［10-11］。在本實驗中，注射LPS后，肺泡上皮和毛細血管內皮屏障功能明顯受損，從而導致肺泡內有大量的蛋白和液體滲出并釋放大量炎性因子，同時肺組織中p-Akt表達明顯降低;而預先使用phen后肺泡內滲出和炎性因子釋放明顯減少，可能與活化PI3K/Akt信號轉導通路導致p-Akt表達增加，加快了損傷的肺上皮和毛細血管內皮屏障修復致使滲出減少有關，該結果與先前學者報道的加速離體肺上皮細胞機械性損傷修復相一致［5，9］。

總之，本實驗證實，PTEN抑制劑在LPS導致的ALI中發揮著重要的保護作用。這一作用可能與其誘導肺組織中Akt活化，進而加快肺泡上皮和毛細血管內皮屏障的修復，減少肺泡內蛋白和液體的滲出及炎性因子的釋放有關。短暫抑制PTEN在人體ALI的詳細機制還需要進一步研究，并且可以考慮作為一種可能的治療方法來預防或者治療ALI。

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