二烯丙基二硫下調cyclin D1和CDK4的表達誘導人鼻咽癌CNE2細胞G1期阻滯

胡 波，邱青朝，賀修培，趙其輝，賀修勝

鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC)是東南亞及我國南方地區常見的惡性腫瘤之一，嚴重危害著人類的健康與生命［1-2］。大蒜及其烯丙基硫化物抗腫瘤實驗研究主要表現為抑制腫瘤細胞生長，誘導腫瘤細胞分化和凋亡，其作用機制可能為調節細胞周期依賴激酶、參與腫瘤發生的信號轉導，減少癌基因、增加抑癌基因表達，調節生物酶活性等［3］。二烯丙基二硫(diallyl disulfide，DADS)是從大蒜中提取的一種低分子量的脂溶性成分，對各種化學致癌物誘發的胃癌、結腸癌、肝癌、乳腺癌、白血病等有明顯的抑制作用，是一種很有開發潛能的抗癌藥物［4-10］。近期研究表明，腫瘤是多基因變化導致細胞周期紊亂的一類疾病，細胞周期調控機制失活，特別是G1/S和G2/M期檢測點的失活在細胞癌變過程中起著至關重要的作用;采用藥物激活細胞周期調控機制，從而誘導腫瘤細胞凋亡和分化已成為腫瘤治療的一個可行的新途徑［11］。本文以人鼻咽癌CNE2細胞作為研究對象，觀察DADS對CNE2細胞的周期調控作用，探討DADS誘導CNE2細胞周期阻滯相關分子cyclin D1和CDK4動態變化與腫瘤細胞周期表型改變的關系。

1 材料與方法

1.1 細胞系及細胞培養 鼻咽癌細胞系CNE2為低分化鱗狀細胞癌細胞系，由中國預防醫學科學院建系，由南華大學腫瘤研究所提供。CNE2細胞用含10%小牛血清的 RPMI 1640培養液，培養于37℃、含5%CO2的培養箱。待細胞鋪滿培養瓶后傳代，0.125%胰酶消化，加適量含血清培養液吹打成單細胞懸液，按所需濃度接種。DADS加入培養基前用Tween 80溶解，以加有與最高濃度組中等量Tween 80作為溶媒對照組，Tween 80在培養基中最高體積分數低于0.01%。

1.2 藥品及試劑 ADS購自Fluka;Tween 80為華美公司產品;將DADS與Tween 80以1∶2比例充分溶解后，加入0.9%生理鹽水稀釋100倍，作為母液保存于-20℃冰箱中。RPMI 1640購置Gibco公司;MTT為Amresco公司產品;BCA蛋白定量試劑盒為Pierce公司產品;TRIzol和AMV逆轉錄試劑盒為Promega公司產品;cyclin D1、CDK4和β-actin單克隆抗體為北京中杉金橋生物技術公司產品。

1.3 引物 所用引物序列均經Primer 5.0設計，由大連寶生物公司合成。具體序列如下:cyclin D1上游:5′-TGGTGAACAAGCTCAAGTGGA-3′，下 游:5′-ACTCTGGAGAGGAAGCGTGTG-3′，擴 增 產 物 256 bp;CDK4上游5′-TGATGCGCCAGTTTCTAAGAGG-3′，下游:5′-GGTCGGCTTCAGAGTTTCCACA-3′，擴增產物 308 bp;內參 β-actin上游:5′-GGACCTGACTGACTACCTC-3′，下 游:5′-CATACTCCTGCTTGCTGAT-3′，擴增產物 553 bp。

1.4 MTT實驗 取對數生長期細胞，按1×104個細胞/孔接種于96孔培養板，培養24 h后，換成無酚紅、無血清的RPMI 1640培養基，加入處理因素，設立0對照、空白對照和處理組，每組取6個復孔，繼續培養到預定的時間。然后每孔加入20 μl的5 g·L-1的MTT/PBS溶液，再培養4 h后小心吸去全部上清液，每孔加入200 μl DMSO，振蕩搖勻，使結晶充分溶解。置酶聯免疫儀上檢測波長570 nm各孔吸光度值，并計算抑制率。抑制率/IR%=(1-處理組平均吸光度值/對照組平均吸光度值)×100%。

1.5 流式細胞儀(FCM)檢測 不同濃度DADS處理CNE2細胞48 h后，收集1×109·L-1細胞，用體積分數為70%乙醇固定，4℃保存待用。采用PI染色，流式細胞儀檢測細胞群體中處于各個細胞周期的細胞比例。

1.6 RT-PCR鑒定 按TRIzol試劑說明程序，分別抽提不同濃度DADS處理CNE2細胞(48 h)總RNA，逆轉錄反應參照AMV逆轉錄試劑盒說明，在20 μl體系中加2 μg總 RNA進行 cDNA的合成。以cyclin D1、CDK4基因的上下游引物進行PCR擴增，反應條件:先94℃變性5 min，94℃變性40 s，55℃退火35 s，72℃延伸1 min循環，總共35個循環，最后72℃延伸8 min。以β-actin作為內參照，PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳后紫外透射儀下觀察照像。凝膠用薄層掃描儀進行灰度掃描，分析各產物的灰度值(V值)，將目的基因的V值(Vx)分別與對應標本的β-actin相比，相對表達強度Rx代表樣本目的基因相對表達量，Rx=Vx/β-actin。

1.7 Western blot分析 不同濃度 DADS處理CNE2細胞48 h后，收集細胞，提取細胞總蛋白，BCA法蛋白定量。取20 μg蛋白，100℃變性5 min;10%聚丙烯酰胺凝膠電泳后轉膜;膜用5%脫脂牛奶封閉1 h，加入 cyclin D1(1∶500)或 CDK4(1∶200)一抗，4℃搖過夜，TBS-T 洗膜3×5 min，HRP標記二抗(1∶2 000)室溫孵育1 h，TBS-T洗膜3×5 min，ECL發光劑曝光，顯影。

1.8 統計學處理 結果采用SPSS12.0統計學軟件進行分析，用χ2檢驗，t檢驗比較處理組與對照組的區別，應用Sigma plot 8.0軟件進行相應的圖像處理。

2 結果

2.1 DADS對CNE2細胞的增殖抑制作用 MTT

法測定結果顯示，CNE2細胞在各處理條件下的OD570值及抑制率:90、140、240、400 μmol· L-1DADS處理組其吸光度值比對照組低，而且隨著濃度增加其吸光值明顯降低，90、140、240、400 μmol·L-1DADS對CNE2細胞增殖的抑制率分別為4.0%、13.8%、25.8%、51.2%。Tween 80作為溶媒對照組對細胞增殖無抑制作用。上述結果表明，DADS抑制CNE2細胞增殖的 IC50值在240～400 μmol·L-1之間，統計學分析顯示各濃度組之間差異均有顯著性(Tab 1，P＜0.05)。

Tab 1 The OD570 values of CNE2 cells exposed to DADS at 48 h(±s，n=3)

Tab 1 The OD570 values of CNE2 cells exposed to DADS at 48 h(±s，n=3)

*P＜0.05 vs control

Group Concentration/μmol·L-1 Optical density OD570 Inhibition/%Control 0.782±0.029 Tween 80 0.776±0.040 0.8 DADS 90 0.750±0.021 4.0*140 0.674±0.026 13.8*240 0.580±0.032 25.8*400 0.381±0.014 51.2*

2.2 DADS對CNE2細胞周期的影響 流式細胞術檢測結果顯示，90、140、250、400 μmol·L-1DADS作用 CNE2細胞 48 h后，G1期百分率分別為41.2%、48.4%、50.0%、58.3%，與對照組 26.7%相比差異有顯著性(Tab 2，P＜0.05);說明DADS呈濃度依賴性對CNE2細胞有G1期阻滯作用。

Tab 2 Effect of different concertations of DADS on the cell cycle of CNE2 cells± s，n=3)

Tab 2 Effect of different concertations of DADS on the cell cycle of CNE2 cells± s，n=3)

*P＜0.05 vs control

Group Concentration/μmol·L-1 Cell cycle G1 S G2 Control 26.7±1.4 70.1±0.3 1.6±0.3 Tween 80 27.4±1.1 72.1±1.0 1.1±0.4 DADS 90 41.2±0.7 56.4±1.5 2.1±0.5 140 48.4±0.9* 49.7±1.7 1.2±0.2 250 50.0±1.5* 47.4±0.8 2.0±0.9 400 58.3±1.5*39.6±1.1 1.7±0.6

2.3 DADS 對CNE2 細胞cyclin D1、CDK4 mRNA表達的影響 RT-PCR檢測不同濃度DADS處理CNE2細胞48 h后，cyclin D1、CDK4 mRNA的表達變化情況(實驗重復3次)。結果顯示，對照組cyclin D1、CDK4 mRNA表達水平較強，不同濃度DADS處理48 h后，cyclin D1、CDK4 mRNA表達水平隨著濃度增加而減弱，到 400 μmol·L-1時，cyclinD1、CDK4 mRNA的表達已分別降到對照組的14%、30%，差異有顯著性(Fig 1、2，P ＜0.05)。

Fig 1 Effect of DADS on expression of cyclin D1 in CNE2 cells by RT-PCRA:1:Control;2:Tween 80;3:90 μmol·L-1DADS;4:140 μmol·L-1DADS;5:240 μmol·L-1DADS;6:400 μmol·L-1DADS;M:DNA marker;B:Using the gray value of β-actin as an internal reference，and compared with the mean gray values of cyclin D1.*P＜0.05 vs control

Fig 2 Effect of DADS on expression of CDK4 in CNE2 cells by RT-PCRA:1:Control;2:Tween 80;3:90 μmol·L-1DADS;4:140 μmol·L-1DADS;5:240 μmol·L-1DADS;6:400 μmol·L-1DADS;M:DNA marker.B:Using the gray value of β-actin as an internal reference，and compared with the mean gray values of CDK4.*P＜0.05 vs control

2.4 DADS 對 CNE2細胞 cyclin D1、CDK4蛋白表達的影響 Western blot分析檢測CNE2細胞經不同濃度DADS處理48 h后，與對照組相比，cyclin D1、CDK4蛋白表達逐漸下降，到DADS濃度為400 μmol·L-1時，cyclin D1、CDK4 表達已分別降到對照組的12%、26%，差異具有顯著性(Fig 3，P＜0.05)。

3 討論

DADS是從大蒜中分離提取的一種油溶性的單體化合物，其藥理作用廣泛，大量實驗證據表明，DADS具有明顯抑制人胃癌、結腸癌、肝癌、白血病等多種腫瘤細胞增殖的作用，呈濃度-效應依賴關系;并可誘導這些腫瘤細胞發生周期阻滯的作用。本研究通過MTT比色實驗結果顯示，DADS濃度從90、140、240 到 400 μmol·L-1處理 CNE2 細胞，其吸光度值比對照組低，而且隨著濃度增加逐漸減低;相反，隨著濃度增加，DADS對CNE2細胞增殖的抑制率從4.0%、13.8%、25.8%到51.2%逐漸增強，表明DADS對CNE2細胞具有明顯的生長抑制作用，呈現濃度-效應依賴關系;流式細胞術分析結果表明，DADS可阻滯CNE2細胞于G1期，并呈濃度依賴性。上述研究結果表明，DADS處理CNE2細胞后，其細胞增殖速度減慢，細胞增殖周期G1期延長，可能與DADS所致相關周期阻滯分子的表達改變有關。

Fig 3 Effect of DADS on expression of cyclin D1 and CDK4 in CNE2 cells by Western blotA:1:Control;2:Tween 80;3:90 μmol·L-1DADS;4:140 μmol·L-1DADS;5:240 μmol·L-1DADS;6:400 μmol·L-1DADS.B:Using the gray value of β-actin as an internal reference，and compared with the mean gray values of cyclin D1.C:Using the gray value of β-actin as an internal reference，and compared with the mean gray values of CDK4.*P＜0.05 vs control

細胞周期是一個復雜有序并受嚴格調控的過程，它分為G1期、S期、G2期和M期4個時期。細胞周期調控是在G1期、S期和G2/M期3個控制點的控制下，通過各種調控因子的激活和失活，使細胞依次啟動和完成細胞分裂的過程。細胞周期中各種調節因子組成復雜的網絡系統，該系統包括細胞周期素(cyclins)、細胞周期蛋白依賴性激酶(CDKs)、細胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子(CKIs)，其核心為CDKs的活性表達與調控，cyclins起著正調控作用，而CKIs為負調控因子［12］。細胞周期調控機制的紊亂，特別是G1/S期檢測點和G2/M期檢測點的改變，在細胞癌變過程中發揮著至關重要的作用［13-14］。cyclin Dl、CDK4 是 G1/S 期關鍵的正性調節因子，兩者首先結合形成cyclin Dl/CDK4復合物，激活抑癌基因pRb，pRb磷酸化后，與轉錄因子E2F分離，解除了對E2F的抑制作用，使E2F發揮轉錄活性，從而促進細胞增殖［15-16］。當 cyclin Dl、CDK4基因激活時，則cyclin Dl、CDK4蛋白持續高表達，將導致G1期縮短，提前進入S期，使細胞增殖失控，最終形成腫瘤［17］。本實驗通過 RT-PCR和Western blot分析顯示，CNE2細胞cyclin Dl和CDK4的表達量較高;隨著DADS處理CNE2細胞濃度逐漸增加時，其表達量反而減少，與對照組相比差異具有統計學意義。上述結果表明，DADS誘導CNE2細胞G1期阻滯的主要機制可能是通過降低cyclin Dl和CDK4表達量，從而負調控G1/S期檢測點，阻滯細胞由G1期進入S期。

綜上所述，DADS能抑制CNE2細胞增殖，其機制可能與DADS誘導CNE2細胞cyclin Dl和CDK4表達下調，將瘤細胞阻滯于G1期有關，但其作用的確切分子機制仍有待進一步研究，從而找出DADS抗腫瘤的靶點。

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