烙鐵頭蛇毒中一個具有抗補體活性金屬蛋白酶的純化和性質研究

閆銀萍，孫黔云

補體是人體重要的免疫防御系統，但過度激活會引發一系列的病理生理反應，參與多種疾病的發生發展［1］。尋找有效的補體抑制成分，能為探索相關疾病的發生發展，以及預防和治療由補體引起的各種炎癥反應及相關的病理損傷提供物質基礎和參考依據。蛇毒是自然界中最復雜的動物毒素，含有多種蛋白質、多肽及酶類，很多蛇毒都對補體系統有作用［2］，蛇毒已成為尋找和發現新型抗補體蛋白的重要資源庫。烙鐵頭蛇(Trimeresurus mucrosquamatus)是我國常見劇毒蛇之一，主要分布在我國南方及臺灣地區，其蛇傷較為常見，臨床主要表現為局部出血、腫脹、疼痛，嚴重時血液不凝，全身出血等［3］。至今已從烙鐵頭蛇毒中分離純化出與纖溶和血小板相關的多個活性成分［4-6］，但總體上對烙鐵頭蛇毒尚缺乏系統深入的研究。針對烙鐵頭蛇毒蛋白開展相關研究對于認識和揭示烙鐵頭蛇傷機制和臨床治療以及潛在應用價值具有重要意義。本文報道了烙鐵頭蛇毒中一個具有抗補體活性金屬蛋白酶的分離純化及部分性質研究。

1 材料與方法

1.1 材料 烙鐵頭蛇毒產自湖南省武陵山區;眼鏡蛇毒因子(cobra venom factor，CVF)參照文獻［7］制備;人微血管內皮細胞株HMEC由本實驗室傳代培養;DEAE Sephadex A-50凝膠、Sephacryl S-100凝膠、Hitrap SP HP柱(瑞典Amersham Pharmacia Biotech公司);兔抗綿羊紅細胞抗體(溶血素)、乙二醇雙(2-氨基乙醚)四乙酸［Ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N，N，N′，N′-tetraacetic acid，EGTA)］、纖維蛋白原、苯甲酰-L-精氨酸乙酯(Nα-Benzoyl-L-arginine ethyl ester hydrochloride，BAEE)、偶氮酪蛋白(azocasein，美國Sigma公司);蛋白質分子量標準(大連TaKaRa公司);人補體單一成分C3、C5(德國Calbiochem公司);P-selectin試劑盒(武漢博士德生物有限公司);BCA蛋白定量試劑盒(江蘇碧云天生物技術研究所);綿羊紅細胞、兔紅細胞采自貴陽醫學院實驗動物中心;♀昆明種小鼠購自貴陽醫學院實驗動物中心，合格證號:SCXK(黔)2002-0001;混合人血清由本實驗室健康志愿者獻血制備而得;其它試劑均為進口或國產分析純。

1.2 儀器 AKTA Prime蛋白層析系統、Gene Quant紫外分光光度計(瑞典Amersham Pharmacia Biotech公司);Spectra MAX-190連續波長酶標儀(美國MD公司);5810R冷凍離心機(德國Eppendorf公司)。

1.3 方法

1.3.1 烙鐵頭蛇毒抗補體蛋白的分離純化 1.0 g烙鐵頭蛇粗毒干粉溶于7 ml的50 mmol·L-1Tris-HCl緩沖液(pH 8.9)，2 000 r·min-1離心 10 min后取上清上樣于同種緩沖液平衡好的DEAE Sephadex A-50陰離子交換層析柱(2.6 cm×90 cm)，充分洗脫后進行0～0.4 mol·L-1NaCl梯度洗脫，流速為24 ml·h-1，每管收集6 ml，測定各洗脫峰抗補體活性。將活性峰凍干后溶于1 ml 10 mmol·L-1PB緩沖液(pH 7.5)，上樣于同種緩沖液平衡好的Sephacryl S-100凝膠柱(1.6 cm×90 cm)，流速為15 ml·h-1，每管 3 ml。收集活性峰上樣于 AKTA Prime 1 ml HiTrap SP HP陽離子交換層析柱，流速為1 ml·min-1，收集活性峰。SDS-PAGE檢測純度，更換緩沖液為 PBS緩沖液，BCA蛋白定量后于-80℃凍存備用。

1.3.2 分子量及等電點測定 15%SDS-PAGE測定目標蛋白在還原與非還原條件下的表觀分子量，方法參照文獻［8］。蛋白質分子量標準為磷酸酶b(97.2 ku)、牛血清蛋白(66.4 ku)、卵清蛋白(44.3 ku)、碳酸苷酶(29.0 ku)、胰蛋白酶抑制劑(20.1 ku)、溶菌酶(14.3 ku)。

等電聚焦測定目標蛋白變性條件下的等電點，方法參照文獻［8］。

1.3.3 抗補體活性測定

1.3.3.1 經典途徑溶血抑制作用測定 將樣品溶液、人血清(GGVB++緩沖液1∶10稀釋)各50 μl混合后于37℃預孵30 min或不預孵，加入100 μl致敏綿羊紅細胞(5×1011cells·L-1，GGVB++緩沖液配制)，37℃水浴孵育30 min后，加入1 ml冷生理鹽水終止反應，2 000 r·min-1離心10 min，取上清于405 nm測定吸光度。

1.3.3.2 替代途徑溶血抑制作用測定 樣品溶液、人血清(GVB-緩沖液1∶3稀釋)各50 μl混合后于37℃預孵30 min或不預孵，加入100 μl兔紅細胞(1.5×1011cells·L-1，GVB-Mg-EGTA 緩沖液配制)，37℃水浴孵育30 min后再加入0.5 ml冷生理鹽水終止反應，2 000 r·min-1離心10 min，取上清于405 nm測定吸光度。

1.3.4 補體單一成分C3、C5酶切裂解檢測 10 μl目標蛋白(5 μg)分別與 5 μl人 C3、C5蛋白(各 5 μg)于37℃水浴孵育4 h，12%SDS-PAGE檢測。

1.3.5 P-selectin檢測 22 μg目標蛋白與50 μl人血清(PBS緩沖液1∶10稀釋)37℃預孵30 min，加至孵育24 h的以5×107cells·L-1接種于96孔板的人微血管內皮細胞(HMEC)中，培養20 min后，取細胞上清，2 000 r·min-1離心10 min，取上清液按試劑盒說明書測定P-selectin。以眼鏡蛇毒因子(CVF)激活補體誘導內皮細胞釋放P-selectin作為陽性對照。

1.3.6 蛋白水解酶活性檢測

1.3.6.1 纖維蛋白原水解活性 參照文獻［8］的方法加以改動。300 μl質量分數為0.2%纖維蛋白原溶液(600 μg，50 mol·L-1Tris-HCl，pH 7.5，0.15 mol·L-1NaCl配制)加入150 μl目標蛋白溶液(10 μg)于37℃水浴孵育1/12、1/2、1、3、6、9、12、24 h 和36 h后，12%SDS-PAGE檢測。

1.3.6.2 精氨酸酯酶活性 參照文獻［8］的方法。BAEE作為底物，100 μg目標蛋白加至3 ml BAEE(1 mol·L-1，67 mmol·L-1，pH 7.0 的 PB 配制)中，于37℃水浴孵育6 h后，253 nm測定吸光度。烙鐵頭粗毒作為陽性對照。

1.3.6.3 偶氮酪蛋白水解活性 參照文獻［8］的方法。100 μg目標蛋白加入1 ml azocasein(5 g·L-1，60 mmol·L-1NaHCO3配制)于37℃水浴孵育6 h后，加入1 ml 1.16 mol·L-1高氯酸終止反應，溶液過濾后于390 nm測定吸光度。烙鐵頭粗毒作為陽性對照。

1.3.7 蛋白水解酶抑制作用研究 2.5 μg目標蛋白分別與 EDTA(10 mmol·L-1)、1，10-phenanthroline(10 mmol·L-1)、PMSF(10 mmol·L-1)、SBTI(0.5 g·L-1)、EGTA(50 mmol·L-1)于 37℃水浴孵育 1 h，以及與 EGTA(10 mmol·L-1)預孵 1、2、3 h，再加入質量分數為0.2%的纖維蛋白原溶液于37℃水浴孵育1 h，12%SDS-PAGE檢測。

1.3.8 水腫活性檢測 參照文獻［9］的方法加以改動。♀昆明種小鼠(體質量約18～20 g，n=6)，右、左后足分別注射0.1 μg·g-1目標蛋白和等體積PBS緩沖液，1 h后處死，于相同位置剪下左、右后足，稱重后計算腫脹率/%=［(右足重量-左足重量)/左足重量］×100%。

1.3.9 出血毒活性檢測 參照文獻［10］的方法加以改動。♀昆明種小鼠(體質量約18～20 g，n=6)背部皮下注射2.5 μg·g-1目標蛋白，24 h處死小鼠后剝皮檢測。烙鐵頭粗毒作為陽性對照。

2 結果

2.1 TMAC-1的分離純化 烙鐵頭蛇毒經DEAE Sephadex A-50陰離子交換層析得到14個蛋白洗脫峰，其中45～65管和250～260管具有抗補體活性(Fig 1A);收集45～65管活性峰凍干并溶解后上樣至Sephacryl S-100凝膠層析，洗脫峰30～36管和46～56管具有抗補體活性(Fig 1B);收集30～36管活性峰上樣至HiTrap SP HP陽離子交換柱，第1個離子峰具有抗補體活性(Fig 1C)，收集即得目標蛋白，命名為TMAC-1。

Fig 1 The purification of TMAC-1

2.2 理化性質 15%SDS-PAGE檢測表明，TMAC-1在還原條件下分子量約為25 ku，非還原條件下分子量約為24 ku(Fig 2A)。等電聚焦電泳顯示TMAC-1等電點為9.0(Fig 2B)。

Fig 2 Electrophoresis of TMAC-1

2.3 抗補體活性測定 TMAC-1在預孵和不預孵條件下均能抑制補體經典途徑和替代途徑的溶血，并呈現劑量依賴性(Fig 3)。在預孵條件下，對經典途徑和替代途徑溶血的IC50分別為62、29 mg·L-1;不預孵條件下，其 IC50分別為263、246 mg·L-1。

Fig 3 Inhibitory effect of TMAC-1 on complement hemolysisA and B:Represented the inhibitory effect of TMAC-1 on the classical pathway and the alternative pathway of complement with preincubation or without preincubation，respectively

2.4 補體單一成分C3、C5裂解作用 TMAC-1對C3、C5有裂解作用(Fig 4)。在還原電泳條件下，經5 μg TMAC-1作用4 h后，可見C3的α鏈被降解，β鏈未見明顯降解，而C5的α鏈和β鏈被完全降解。

Fig 4 Digest of C3 and C5 by TMAC-1

2.5 P-selectin測定 TMAC-1與人血清充分孵育的混合物不能誘導人微血管內皮細胞釋放P-selectin(Fig 5)。

Fig 5 Effect of TMAC-1 on reducing HMEC to release P-selectinThe difference between(TMAC-1+NHS)and NHS is not significant on statistics

2.6 蛋白水解酶活性及抑制劑對蛋白水解酶活性的影響

2.6.1 纖維蛋白原水解活性 TMAC-1能夠降解纖維蛋白原(Fig 6A)。10 μg樣品與600 μg纖維蛋白原作用結果顯示TMAC-1在36 h內能夠依次降解纖維蛋白原的Aα鏈、Bβ鏈、和γ鏈。

2.6.2 抑制劑對纖維蛋白原水解活性的影響TMAC-1對纖維蛋白原水解作用能被EDTA(10 mmol·L-1)、1，10-phenanthroline(10 mmol·L-1)、EGTA(50 mmol·L-1)完全抑制，不受 PMSF(10 mmol·L-1)、SBTI(0.5 g·L-1)的抑制(Fig 6B)。

Fig 6 Fibrinogenolytic activity of TMAC-1

2.6.3 其他蛋白水解酶活性 TMAC-1無BAEE水解活性，具有微弱的偶氮酪蛋白水解活性。

2.7 水腫活性 0.1 μg·g-1TMAC-1誘導的小鼠足跖腫脹率為(36.7±3.7)%，見Fig 7。

Fig 7 Effect of TMAC-1 on inducing edema 1:PBS;2:TMAC-1

2.8 出血毒活性 2.5 μg·g-1TMAC-1注射小鼠皮下，24 h后未發現出血毒性。

3 討論

本實驗經過DEAE Sephadex A-50陰離子交換層析、Sephacryl S-100分子篩、Hitrap SP HP陽離子交換層析從湖南產烙鐵頭蛇毒中分離純化出一個分子量為25 ku、等電點為9.0的抗補體蛋白TMAC-1。該蛋白不具有出血毒活性，具有水腫活性，能夠依次降解纖維蛋白原的Aα、Bβ、γ鏈，該活性能夠被金屬蛋白酶抑制劑完全抑制，不受絲氨酸蛋白酶抑制劑的影響，同時TMAC-1不具有精氨酸酯酶活性，上述結果提示TMAC-1是一個非出血性的金屬蛋白酶。

目前為止，已從各類蛇毒中分離純化出很多金屬蛋白酶，根據結構域的不同將金屬蛋白酶分為4類:僅含金屬蛋白酶結構域的P-Ⅰ型;含有金屬蛋白酶和disintegrin結構域或disintegrin-like結構域的P-Ⅱ型;含有金屬蛋白酶結構域、disintegrin-like結構域和富含Cys結構域的P-Ⅲ型;以及包含金屬蛋白酶結構域、distintergrin-like結構域、Cys結構域和C-型凝集素結構域的 P-Ⅳ型［11］。P-Ⅰ型金屬蛋白酶分子質量約為20～30 ku，根據分子質量我們推測TMAC-1可能是一個只含有金屬蛋白酶結構域的P-Ⅰ型金屬蛋白酶。

目前已報道的烙鐵頭蛇毒中有多種活性成分［3-6］，其中從臺灣產烙鐵頭中分離純化有TM-1、TM-2和 TM-3等金屬蛋白酶［3］，分子質量均在24 ku左右，它們能夠裂解纖維蛋白原的Aα和Bβ鏈。本實驗從湖南產烙鐵頭蛇毒中分離純化出的金屬蛋白酶TMAC-1，能夠依次降解Aα鏈、Bβ鏈和γ鏈，這在金屬蛋白酶中是較為少見的。并且該活性在EGTA終濃度為10 mmol·L-1時或延長預孵時間至3 h也不能被完全抑制，但當EGTA濃度增大后該活性能被完全抑制，但這一現象具體原因還需進一步深入研究。

目前已發現了多個作用于補體的蛋白酶，如從Crotalus molossus molossus蛇毒中分離純化出的抑制豚鼠補體的金屬蛋白酶 M5［12］，Naja oxiana眼鏡蛇毒中抑制經典途徑C3轉化酶形成的金屬蛋白酶oxiagin［13］，以及從 Trimeramaturus flavoviridis蛇毒中分離出異源性的 C3/C5轉化酶 flavoxobin［14］，它是一種絲氨酸蛋白酶，通過直接酶切補體C3、C5成分來激活補體替代途徑并生成活性片段。本工作從湖南產烙鐵頭蛇毒中分離純化出具有抗補體作用的金屬蛋白酶TMAC-1，對補體的經典途徑和替代途徑的溶血均有抑制作用。SDS-PAGE結果顯示，TMAC-1能夠裂解C3、C5，但與血清孵育產物不能刺激HMEC釋放P-selectin，從而推測TMAC-1是通過抑制補體而不是激活補體來發揮抗補體作用。又因TMAC-1對補體替代途徑溶血的抑制作用較對經典途徑的強，故而我們推測，TMAC-1可能還有其他更重要的靶標成分，如替代某些特有的補體成分:B因子、D因子等，從而抑制補體激活，但其確切的抗補體作用機制還需進一步研究探討。

烙鐵頭蛇咬傷一般表現為腫脹、出血、疼痛等，其中的炎癥反應主要是由于毒液中的金屬蛋白酶引起的。蛇毒金屬蛋白酶可通過金屬蛋白酶結構域或去整合素結構域破壞細胞外基質，或者誘導內皮細胞釋放促炎癥因子或黏附分子，從而參與炎癥的發生發展［11，15］。抗補體作用研究顯示 TMAC-1能夠裂解C3、C5，但TMAC-1本身或其酶切補體的產物都不能誘導內皮細胞釋放P-selectin，表明其酶切補體并不能產生生理活性片段，這將有利于TMAC-1在抑制補體上的應用。而TMAC-1能夠誘導小鼠足跖腫脹，這可能是與其酶切補體成分無關，而是由其自身的作用導致的。

本文從烙鐵頭蛇毒中分離純化出一個具有抗補體活性的金屬蛋白酶TMAC-1，通過酶切補體特定成分而抑制補體激活。TMAC-1能夠依次降解纖維蛋白原的Aα鏈、Bβ鏈和γ鏈，能誘導水腫，但不具有出血毒活性。本工作將有助于加深對烙鐵頭蛇毒蛋白及蛇傷機制的認識，有助于烙鐵頭蛇傷的治療，但其酶切補體的生物學意義以及潛在的應用價值，還需進一步研究。

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