射干麻黃湯對哮喘大鼠氣道炎癥及外周血Th1/Th2平衡的影響

趙 紅 王長海 魏亞強

第四軍醫大學西京醫院（西安 710032）

哮喘的本質是氣道炎癥，各種嗜酸性粒細胞、T淋巴細胞、單核細胞、中性粒細胞等免疫相關細胞反常聚集和激活參與了支氣管哮喘的調節。此外，許多研究已證實T1亞群細胞/T2亞群細胞(Th1/Th2）平衡失調，Th2細胞活化亢進在哮喘發病機制中發揮重要作用[1]。

大量臨床研究表明，中藥射干麻黃湯治療支氣管哮喘療效確切，具有遠期療效穩定、不良反應少、毒副作用罕見等特點。但對其作用機制的研究甚少。本實驗通過觀察射干麻黃湯對哮喘大鼠支氣管肺泡灌洗液（BALF）中炎癥細胞、白細胞介素4(IL－4）和γ－干擾素(IFN－γ）/IL－4比率的影響，探討其對控制哮喘氣道炎癥和Th1/Th2細胞亞群失衡的影響，揭示其治療支氣管哮喘的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料 （1）動物：選取6周齡清潔級SD大鼠40只，雌性，體質量（180±20）g，由第四軍醫大學實驗動物中心提供，許可證號：SCXK(軍）2007－007。（2）藥物及試劑：卵蛋白干粉由美國Sigma公司生產；地塞米松片（0.75mg/片），由上海信宜制藥股份有限公司生產,批號020401；射干麻黃湯(射干9g，麻黃12g，半夏 12g，紫菀 9g，款冬花 9g，大棗 12g，細辛 3g，生姜 12g，五味子12g）組方藥材由第四軍醫大學西京醫院中藥房提供；大鼠IL－4 ELISA試劑盒、IFN－γ ELISA試劑盒由北京晶美生物工程有限公司生產。（3）主要儀器：402型超聲霧化器由上海四菱醫療器械廠生產；美國Beckman J 2型低溫高速離心機。

1.2 方法 （1）造模：按文獻[2]方法操作。實驗用雌性大鼠40只適應性飼養1周后，隨機分為正常對照組、哮喘組、地塞米松組和射干麻黃湯組，每組10只。除正常組外，第0、7天于大鼠腹腔注射1mL的抗原液 (含卵蛋白100mg、氫氧化鋁干粉100mg、滅活百日咳桿菌5×109個）致敏，第7～21日用超聲霧化器給大鼠霧化吸入10g/L卵蛋白生理鹽水懸液，30min/d，至出現煩躁不安、呼吸急促、腹肌抽搐、撓鼻等哮喘發作表現。正常對照組：按哮喘組方法，用生理鹽水代替卵蛋白霧化吸入與腹腔注射。地塞米松組：自造模第1日起灌服地塞米松，劑量為1mg/(kg·d）。射干麻黃湯治療組：自造模第1日起，每日灌服射干麻黃湯劑20g/(kg·d），生藥含量2g/mL，每日1次，各組均連續用藥7d。（2）BALF收集：按文獻[3]方法操作。造模及相應處理完成后24h，烏拉坦腹腔注射麻醉(1.5g/kg），結扎右肺門根部，行氣管插管，4mL生理鹽水緩慢注入肺內，輕輕按摩肺組織30s，緩慢回抽，回收BALF，反復3次，回收率大于90%。取搖勻的BALF少許滴于細胞計數板上，光鏡下計數細胞總數，然后將BALF離心(1000r/min離心10min），取適量沉渣制備細胞涂片，采用瑞氏染色法染色，油鏡下計數200個細胞并分類。（3）血漿標本的采集：從頸動脈取血3mL，加肝素鈉抗凝，靜置2h后，2000r/min離心15min，提取血漿保存于－20℃冰箱待測細胞因子。（4）細胞因子檢測：采用酶聯免疫吸附法行IL－4及IFN－γ水平檢測，嚴格按試劑盒說明進行。

1.3 統計學處理 應用SPSS 12.0統計軟件，計數資料以(）表示。采用 t檢驗、Dunnett檢驗和S－N－K法檢驗。

2 結果

2.1 各組一般情況觀察 見表1。

表1 各組大鼠一般情況變化

2.2 各組BALF中炎癥細胞的比較 見表2。哮喘組大鼠細胞總數、嗜酸性粒細胞、中性粒細胞、淋巴細胞計數均顯著高于正常對照組 (P＜0.01），2個治療組細胞總數及各炎癥細胞數較哮喘組明顯減少（P＜0.01）。地塞米松組嗜酸性粒細胞、淋巴細胞數顯著低于射干麻黃湯組（P＜0.05），2個治療組間細胞總數中性粒細胞數的差異無統計學意義（P＞0.05）。

表2 各組BALF中炎癥細胞的變化 (×106/L，）

表2 各組BALF中炎癥細胞的變化 (×106/L，）

組 別正常對照組哮喘組地塞米松組射干麻黃湯組n 10 10 10 10細胞總數20.50±4.14 32.50±6.02*10.00±2.83△21.10±3.35△嗜酸性粒細胞0.40±0.20 3.94±0.53*1.71±0.54△2.25 ±0.68△▲中性粒細胞1.53±0.44 8.46±1.11*4.43±0.78△5.37±1.16△淋巴細胞1.32±0.43 8.05±1.07*2.76±0.91△3.66 ±0.68△▲

2.3 各組大鼠細胞因子水平的比較 見表3。哮喘組大鼠較正常組血清中IL－4明顯增加（P＜0.01），2個治療組大鼠較哮喘組血清中IL－4明顯減少（P＜0.01），射干麻黃湯組與地塞米松組血清中IL－4相近（P＞0.05）。哮喘組大鼠IFN－γ/IL－4較正常組明顯減少（P＜0.01），2個治療組大鼠較哮喘組大鼠血清中IFN－γ/IL－4明顯增加（P ＜0.01）；射干麻黃湯組與地塞米松組血清中IFN－γ/IL－4相近（P＞0.05）。

表3 各組外周血IL－4及IFN－γ/IL－4比較 (pg/mL,）

表3 各組外周血IL－4及IFN－γ/IL－4比較 (pg/mL,）

組 別正常對照組哮喘組地塞米松組射干麻黃湯組n 10 10 10 10 IL－4 35.29±5.66 59.73±11.96*42.43±7.02△40.65±5.78△IFN－γ 71.67±10.18 41.30±6.54*52.23±8.46△47.50±6.70△IFN－γ/IL－4 2.04±0.13 0.72±0.18*1.26±0.29△1.19±0.24△

3 討論

支氣管哮喘是由氣道免疫相關細胞的反常活化和聚集以及T淋巴細胞、嗜酸性粒細胞、單核細胞等細胞的功能障礙為特點的慢性氣道炎癥性疾病。氣道慢性炎癥與氣道高反應性密切相關，其不但可導致氣短、聲嘶、胸悶等癥狀，也決定了哮喘的嚴重程度。此外，研究表明，Th1/Th2免疫平衡決定機體對疾病的易感性，是哮喘發病和持續存在的主要免疫學基礎。當Th2細胞反應占主導時，Th1/Th2平衡發生改變，并在哮喘氣道炎癥細胞的趨化、成熟、存活過程中起著重要作用。因此，抑制Th2型反應、增強Th1型反應被認為對哮喘的發病起防治作用[4]。

CD+4T淋巴細胞根據所分泌的細胞因子不同分為Th1和Th2兩個亞群，不同亞群執行著不同的免疫功能。Th1分泌IFN－γ、IL－2、TNF－α和 TNF－β，介導細胞免疫應答。Th1通過增加細胞因子、趨化因子和黏附分子的表達，激活巨噬細胞，使炎癥細胞募集增多并且可以通過多種途徑擴增免疫反應，包括在抗原呈遞細胞和內皮細胞上增加MHCⅠ和MHCⅡ分子水平。當感染中遇到較大的病原體而不被吞噬時，Th2細胞被激活。Th2主要產生 IL－4、IL－5、IL－10和 IL－13，介導體液免疫應答及Ⅰ型變態反應，在哮喘等過敏性炎癥的發生發展中起重要作用[5]。事實上，免疫系統應對環境因素的反應，可以直接或間接影響CD+4T分化成Th1或Th2細胞，從而產生自身免疫性疾病和過敏。

IFN－γ、IL－4分別是Th1和Th2細胞的特征性細胞因子，二者在哮喘發病中從正反兩方面控制CD+4T細胞的分化和功能[6]。IFN－γ由Th1細胞分泌，可以誘導CD+4T細胞分化為Th1細胞，還可以抑制Th2細胞的分化。另一方面，由Th2細胞分泌的IL－4可以誘導CD+4T細胞分化為Th2細胞，還可以抑制Th1細胞的功能。當Th2細胞反應占主導時，Th1/Th2平衡發生改變，引起各種過敏性疾病。對此方面的研究已成為哮喘免疫治療的熱點之一[7，8]。

本研究發現，哮喘大鼠BALF中嗜酸性粒細胞計數增多，提示發生了以嗜酸性粒細胞浸潤為主的氣道炎癥，經灌服射干麻黃湯及地塞米松后，大鼠BALF中嗜酸性粒細胞、中性粒細胞、淋巴細胞較哮喘組明顯減少，說明射干麻黃湯和地塞米松組均有抑制氣道炎癥作用，但與地塞米松比較，射干麻黃湯對嗜酸性粒細胞、淋巴細胞的作用較低。對外周血中IFN－γ、IL－4水平監測發現，哮喘大鼠BALF中IFN－γ蛋白水平明顯下調，IL－4蛋白水平明顯上調，表現出明顯的Th2細胞因子分泌亢進和Th1細胞因子減少，再次證實哮喘中Th1/Th2的免疫失衡，Th2細胞活化亢進的存在。在灌服射干麻黃湯及地塞米松后發現IL－4水平下調，IFN－γ/IL－4明顯增加，使IFN－γ/IL－4比例得以逆轉,這與Deng等[9]在大鼠中觀察到的現象相似。說明射干麻黃湯與地塞米松均可抑制Th2活化，影響Th1/Th2水平，且射干麻黃湯與地塞米松作用相當。

射干麻黃湯出自漢代張仲景《金匱要略》，由射干、麻黃、款冬花、細辛、紫菀、半夏、五味子、大棗、生姜等組成，可“宣肺散寒，化飲止咳，治外感風寒，痰飲上逆，咳而上氣，喉中有水鳴聲”。方中麻黃宣肺散寒，射干開結消痰，并為君藥；生姜散寒行水，半夏降逆化飲，共為臣藥；紫菀、款冬花溫潤除痰，下氣止咳，五味子收斂耗散之肺氣，均為佐藥；大棗益脾養胃，為使藥。諸藥相配，融解表、溫肺、利氣、開痰于一方以分解病邪，共奏溫肺散寒、化痰平喘之功。

綜上所述，本實驗通過射干麻黃湯干預哮喘大鼠模型，證實了射干麻黃湯可以緩解氣道炎癥，調節Th1/Th2的免疫失衡，抑制Th2細胞活化，這可能是其治療支氣管哮喘的作用機制之一，提示射干麻黃湯在治療哮喘方面具有良好的應用前景。

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