補(bǔ)腎固黃湯改善胚泡著床障礙小鼠子宮內(nèi)膜組織形態(tài)的實(shí)驗(yàn)研究

王文娟 余 崢 江勝芳 張昌軍 彭海英

1 鄖陽醫(yī)學(xué)院附屬人民醫(yī)院（十堰 442000）

2 湖北中醫(yī)學(xué)院碩士生（武漢 430061）

胚胎種植關(guān)鍵在于具備有著床能力的胚胎和具有接受胚胎能力的子宮內(nèi)膜。隨著輔助生殖技術(shù)的發(fā)展，胚胎質(zhì)量得到了明顯的提高，但胚胎種植率和臨床妊娠率并無顯著上升，這說明子宮內(nèi)膜對胚胎的接受能力即子宮內(nèi)膜容受性，為胚胎種植的重要約束因素。如何提高子宮內(nèi)膜容受性是目前研究的熱點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)探尋中藥補(bǔ)腎固黃湯對胚泡著床障礙小鼠子宮內(nèi)膜容受性的影響及其機(jī)制，擬從中醫(yī)角度探索改善子宮內(nèi)膜容受性的新方法。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料和方法

1.1 材料 （1）實(shí)驗(yàn)動物：清潔級昆明小鼠，由鄖陽醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供，8～10周，體質(zhì)量25～35g，自由飲水飲食，室溫22～25℃，每天光照10h，黑暗14h。（2）藥物與試劑：補(bǔ)腎固黃湯（熟地黃、當(dāng)歸、丹參等組成），所用中藥購自十堰市人民醫(yī)院中藥房，制成含生藥量1.2g/mL的煎劑，超凈臺內(nèi)分裝入無菌容器內(nèi)，并進(jìn)行高壓消毒、封存，－20℃保存；米非司酮片由湖北葛店人福藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，研缽研碎，溶于丙二醇（國產(chǎn)分析純）中，配置成0.8g/mL懸濁液，4℃保存。

1.2 方法 （1）分組及給藥：將雌鼠隨機(jī)分成3組：正常組、中藥組、模型組，觀察其動情周期，中藥組每1個動情周期后期行補(bǔ)腎固黃湯0.3mL灌胃1次，其余兩組灌服相同體積生理鹽水，持續(xù)2個動情周期，并將動情期差異大的小鼠剔除。第3個動情周期，按雌雄2∶1～3∶1合籠，次晨發(fā)現(xiàn)陰栓者記為妊娠第1天（D1）。從D1開始，每天上午9：00中藥組灌服補(bǔ)腎固黃湯0.3mL，正常組、模型組灌服相同體積生理鹽水。（2）動物造模及標(biāo)本收集：參考文獻(xiàn)[1]的造模方法，D4上午7：00中藥組、模型組皮下注射米非司酮溶液0.1mL。于D5晚上7∶00處死小鼠，收集標(biāo)本。處死小鼠前10min尾靜脈注射0.5%臺盼藍(lán)溶液0.125mL，頸椎脫臼處死小鼠，取出子宮，放入生理鹽水中去除子宮周圍系膜、脂肪，取一側(cè)子宮投入4%多聚甲醛固定12h后，石蠟包埋切片，常規(guī)HE染色。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠子宮大體形態(tài)觀察 見圖1。正常組小鼠較模型組小鼠子宮增粗增長，系膜充血，肉眼可見多個藍(lán)染點(diǎn)，左右對稱；中藥組小鼠較模型組小鼠子宮增粗，藍(lán)染點(diǎn)數(shù)目增多，且可見染色處膨隆，但與正常組比較數(shù)量較少；模型組小鼠子宮細(xì)長，除染色點(diǎn)處膨隆外，其余部分均未改變，藍(lán)染點(diǎn)明顯較前兩組少，且左右不對稱。

圖1 各組小鼠子宮大體觀

2.2 各組小鼠子宮內(nèi)膜組織學(xué)形態(tài)學(xué)表現(xiàn) 見圖2。光鏡下觀察子宮組織HE染色：正常組子宮腺體數(shù)量多，腺體彎曲，腺腔擴(kuò)張，腺腔及宮腔中可見較多分泌物，腺體分布均勻，散布于間質(zhì)中，腺上皮呈單層柱狀排列，核圓形，位于細(xì)胞基底部，間質(zhì)疏松、水腫，子宮腔上皮較厚；中藥組腺體與間質(zhì)發(fā)育同步，腺體數(shù)量多、腺腔彎曲，間質(zhì)疏松、水腫，與正常組表現(xiàn)相似；模型組子宮腺體數(shù)量少，腺體小而直，分布不均勻，聚集于一處，有的間質(zhì)較致密，細(xì)胞體積變小，有的較疏松，表現(xiàn)為腺體、間質(zhì)發(fā)育不同步，子宮腔上皮、腺上皮細(xì)胞變矮、排列紊亂。

圖2 各組小鼠子宮內(nèi)膜HE染色圖片

3 討論

子宮內(nèi)膜容受性是指內(nèi)膜處于一種允許胚胎黏附、穿透并植入而導(dǎo)致胚胎著床的狀態(tài)，是子宮內(nèi)膜接受胚胎著床的一種綜合狀態(tài)[2]。正常子宮內(nèi)膜僅在一個極短的關(guān)鍵時期內(nèi)允許胚泡著床，這一時期約為正常月經(jīng)第20～24天，在這一時期子宮內(nèi)膜受激素、細(xì)胞因子、黏附分子及糖蛋白等多種因素的調(diào)節(jié)，發(fā)生一系列變化，表現(xiàn)出最大的胚泡種植容受性，被稱為“植入窗”期（簡稱窗口期）。

子宮內(nèi)膜容受性下降可以表現(xiàn)為窗口期子宮內(nèi)膜組織形態(tài)學(xué)的改變。在尿LH峰日超聲檢測子宮內(nèi)膜形態(tài)：A型妊娠率明顯高于C型，子宮內(nèi)膜呈現(xiàn)C型改變是胚胎著床障礙的一個重要表現(xiàn)。李權(quán)等[3]比較A、C兩型窗口期子宮內(nèi)膜組織學(xué)形態(tài)，發(fā)現(xiàn)C型子宮內(nèi)膜的腺腔輕度增大，見核下空泡，A型子宮內(nèi)膜的腺腔增大明顯，腺腔內(nèi)分泌旺盛，表明C型子宮內(nèi)膜腺體發(fā)育遲緩，而A型則正常。陳秋梅等[4]發(fā)現(xiàn)高達(dá)81.5%的排卵障礙不孕者子宮內(nèi)膜組織形態(tài)學(xué)表現(xiàn)異常。

米非司酮是一種孕激素受體拮抗劑，能競爭性地與孕激素受體結(jié)合，阻斷孕激素在靶器官發(fā)揮生理效應(yīng)。圍著床期使用低劑量米非司酮拮抗孕激素的作用，可阻斷上皮孕激素受體的下調(diào)，及基質(zhì)旁分泌因子的合成，從而抑制上皮的分泌和基質(zhì)的蛻膜化，達(dá)到阻止胚胎著床的目的。研究顯示，米非司酮可以引起孕鼠胚泡著床率與著床胚胎數(shù)下降，使孕鼠子宮內(nèi)膜發(fā)育滯后，主要表現(xiàn)為內(nèi)膜腺體與間質(zhì)發(fā)育不同步[5]。本實(shí)驗(yàn)也證實(shí)，米非司酮引起的模型組小鼠子宮內(nèi)膜腺體數(shù)量少，腺體小而直，分布不均勻，聚集于一處，有的間質(zhì)較致密，細(xì)胞體積變小，有的較疏松，表現(xiàn)為腺體、間質(zhì)發(fā)育不同步，子宮腔上皮、腺上皮細(xì)胞變矮、排列紊亂。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，“腎主生殖”、“經(jīng)水出諸腎”，腎虛是不孕癥主要病因病機(jī)，腎虛則胎元不固，出現(xiàn)胚胎著床障礙。我國著名中醫(yī)婦科專家黃繩武老先生認(rèn)為不孕癥重點(diǎn)在腎，旁及肝、脾。實(shí)驗(yàn)研究顯示補(bǔ)腎中藥可以改善子宮內(nèi)膜組織學(xué)形態(tài)，增加子宮內(nèi)膜血流，提高子宮內(nèi)膜容受性相關(guān)標(biāo)志物水平，從而改善子宮內(nèi)膜容受性。陳秋梅等[4]收集子宮內(nèi)膜組織形態(tài)學(xué)表現(xiàn)異常的排卵障礙不孕者，給予以補(bǔ)腎為主的調(diào)經(jīng)孕育方藥，藥后內(nèi)膜形態(tài)學(xué)有明顯改善，增殖期和分泌期內(nèi)膜功能明顯活躍旺盛，接近或完全符合正常生理狀態(tài)下的表現(xiàn)。故本研究以補(bǔ)腎為核心，根據(jù)黃體期陽氣升發(fā)之理，以清代名醫(yī)傅青主之補(bǔ)腎助孕良方養(yǎng)精種玉湯（熟地黃、當(dāng)歸、白芍、山茱萸肉）為基本方，加巴戟天、仙靈脾、續(xù)斷以溫補(bǔ)腎陽，佐以女貞子、阿膠、丹參等補(bǔ)血活血，以改善子宮血液循環(huán)，增加子宮內(nèi)膜容受性。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)，經(jīng)過中藥治療后，胚泡著床障礙小鼠較模型組子宮內(nèi)膜腺體數(shù)目增多，腺腔擴(kuò)張、彎曲，腺腔、宮腔均有較多分泌物，與正常組表現(xiàn)相似，表明補(bǔ)腎固黃湯可以改善胚泡著床障礙小鼠子宮內(nèi)膜組織學(xué)形態(tài)。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)米非司酮抗早孕的可能機(jī)制是促使子宮內(nèi)膜發(fā)育不良，而中藥補(bǔ)腎固黃湯可以改善米非司酮藥后子宮內(nèi)膜組織學(xué)形態(tài)，使其與正常保持一致，從而提高子宮內(nèi)膜容受性。米非司酮作為一種孕激素受體拮抗劑，其引起的胚泡著床障礙可以被補(bǔ)腎固黃湯對抗；孕激素可以促進(jìn)子宮內(nèi)膜呈分泌期改變，使子宮內(nèi)膜組織學(xué)形態(tài)符合窗口期特征，適合胚胎著床。補(bǔ)腎固黃湯是否在孕激素分泌及其受體表達(dá)方面有特殊作用是本實(shí)驗(yàn)下階段的研究重點(diǎn)。

[1]劉艷娟,黃光英,龔萍,等.對兩種胚泡著床障礙小鼠模型圍著床期子宮內(nèi)膜形態(tài)結(jié)構(gòu)的比較研究[J].中國藥理學(xué)通報(bào),2006,22(9）：1067 ～ 1070.

[2]高敏芝,李文英,劉桂梅,等.彩色多普勒超聲監(jiān)測子宮內(nèi)膜和內(nèi)膜下血流對IVF患者子宮容受性的預(yù)測價(jià)值 [J].生殖與避孕,2007,27(6）：399 ～403.

[3]李權(quán),譚曉珊,陳家仙,等.A、C型子宮內(nèi)膜種植窗期形態(tài)學(xué)特征[J].中國婦幼保健,2009,24(1）：84～86.

[4]陳秋梅,張樹成,賀彬,等.調(diào)經(jīng)孕育方藥對排卵障礙性不孕者子宮內(nèi)膜感受態(tài)的影響——組織形態(tài)學(xué)分析 [J].中醫(yī)藥學(xué)刊,2004,32(3）：464 ～467.

[5]劉艷娟,黃光英,楊明煒,等.對胚泡著床障礙小鼠子宮內(nèi)膜容受性的研究[J].生殖與避孕,2008,28(3）：144～149.