葛根素對血管性癡呆大鼠腦組織Na+－K+－ATP酶含量、梗死體積及病理學改變的影響

朱慧淵

陜西中醫學院（咸陽 712038）

血管性癡呆 (VaD）是指缺血性、出血性腦血管疾病引起的腦功能損害所致的癡呆。隨著老齡化進程的加快和老齡化程度的加深，VaD患病率將逐漸上升，逐漸增多的癡呆患者已成為家庭和社會的沉重負擔[1]，因而探討VaD的防治也已成為社會和醫學界關注的重要課題。研究發現VaD患者基底前腦、海馬等廣泛腦區存在大量神經元凋亡細胞。本實驗通過生化指標檢測，以研究葛根素對VaD保護作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料 （1）實驗動物：雄性SD大鼠30只，購于浙江省中醫藥大學實驗動物中心，8～12周齡，體質量280～300g。(2）分組：動物隨機分為空白組、模型組、葛根素組。模型組、空白組不作藥物處理，而采用蒸餾水灌胃進行模擬處理。葛根素組采用葛根素100mg/kg灌胃，每日1次，連續7d。(3）模型制備：第7次灌胃后1h對模型組和葛根素組進行VaD模型制備。大鼠VaD模型根據MCAO法復制[1,2]。大鼠使用10%水合氯醛腹腔注射(1g/kg）麻醉后，將其仰臥固定。分離右頸總動脈(CCA）、頸內動脈(ICA）及頸外動脈(ECA）并掛線備用，結扎ECA與CCA，用動脈夾夾閉ICA遠心端后，迅速于ECA與ICA分叉處作一切口，從切口處插入一端加熱成光滑球形尼龍線(直徑為0.25mm，距球端2cm處作標記）。線插入ICA后，于入口處稍稍結扎尼龍線與入口處ICA段，然后松開夾閉ICA的動脈夾，繼續插入尼龍線至稍有阻力后略回撤，至線插入深度為(18.5±0.5）mm左右以實現大腦中動脈阻塞導致腦缺血。再次結扎入口處，尼龍線外留約1cm，縫合皮膚。2h后輕輕提拉所留線頭至有阻力，實現大腦中動脈再灌注24h。，則造模完成。空白組大鼠不作任何手術處理。模型組只結扎ECA與ICA。

1.2 HE染色及酶學測定 將大鼠斷頭處死，在冰臺上迅速取腦，快速分離海馬及大腦皮質，稱重，一部分常規石蠟包埋，冠狀切片，片厚6μm,進行HE染色。一部分取海馬、丘腦、皮層等組織，稱重后用預冷生理鹽水制成1∶10(W/V）的勻漿。3000r/min離心10min,取上清液，按說明書方法測定Na+－K+－ATP酶的含量。

1.3 腦梗死范圍測定 取缺血側腦組織置于－22℃低溫冰箱快速冷凍，始于前囟點前1mm每隔2mm切取冠狀組織6片，置2%TTC溶液中37℃孵育30min待顯色完全。將每片組織片照相，照片用醫學圖像處理軟件處理并評估梗死灶面積及全腦腦片面積，并計算梗死灶體積占全腦腦組織的百分數。

2 結果

2.1 各組HE染色結果比較 HE染色顯示，空白組未見明顯改變，海馬區神經元分布均勻、排列整齊，模型組海馬區神經元局部有一定的損傷，葛根素組有一定程度的改善。

2.2 各組Na+－K+－ATP酶活性比較 見表1。造模后模型組與空白組相比，ATP含量明顯減少 (P＜0.05）。葛根素組ATP含量較模型組升高(P＜0.05）。

表1 各組Na+K+－ATP酶活性比較 [(μmol/(mg·h）,]

表1 各組Na+K+－ATP酶活性比較 [(μmol/(mg·h）,]

與空白組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05。下同

組 別空白組模型組葛根素組n 10 10 10 Na+K+－ATP 5.034±0.068 3.989±0.159*4.905±0.074△

2.3 各組腦梗死體積比較 見表2。腦片經TTC染色后，正常腦組織被染成暗紅色，梗死區則為蒼白色，對比明顯。假手術組基本未出現明顯梗死灶，模型組梗死面積大且灰白梗死區常遍布整個顳頂葉及基底核等重要腦功能區，葛根素組梗死面積則相對較小，并且主要分布于腦葉邊緣。表明葛根素能夠在一定程度上減小腦缺血后梗死范圍。

表2 各組腦梗死體積比較（%，）

表2 各組腦梗死體積比較（%，）

組 別空白組模型組葛根素組n 10 10 10腦梗死體積0 39.8±2.04*14.5±1.82△

3 討論

本實驗采用的改良后的線栓模型，此模型適用于神經元對缺血敏感性、耐受性以及再灌注損傷和溶栓治療時間窗研究，可成功體現血管性癡呆的病理模型[3]。本實驗所選用的動脈線栓模型（MACO）具有以下特點：創傷小,勿需開顱,對全身影響小，腦缺血損傷程度較穩定,術后動物存活期較長。所以采用此模型可以為實驗的成功進行治療及檢測奠定動物模型基礎。

血管性癡呆的治療原則是：迅速改善腦血液循環，增加缺血區的血流量和氧供應，防止腦血管病變的繼續加重，爭取使功能受到抑制的腦細胞較快地恢復活力，增加腦血流量,保護神經元[4,5]。腦組織中Na+K+－ATP酶存在細胞膜上，通過水解ATP逆化學梯度轉運離子，是維持神經元興奮傳導、突觸傳導細胞內環境的物質基礎。老年癡呆產生大量自由基，可直接氧化酶蛋白氨基酸殘基，使酶失活。ATP酶活性可影響神經元細胞內Na+的積聚，K+流失，細胞內環境紊亂更加重細胞的損傷。腦缺血及再灌注引起的腦損傷的主要機制有：氧自由基能引起膜脂質過氧化作用,破壞膜的正常結構，抑制膜蛋白的功能,減少ATP的產生。藥理研究證明,葛根素是由豆科植物野葛干燥根中提取物制成，其化學名為4,7－二羥基－8－D－葡萄糖基異黃酮[6]。本實驗利用葛根素具有抑制中樞神經系統的作用，使之能量消耗減少，使腦細胞較長時間保持活性，從而提高ATP酶的活性，減輕腦水腫與離子代謝障礙，并且對大腦梗死面積的減少也正是與此機理有一定聯系。

[1]Longa Z,Weinstein PR,Carson S，et al.Revesible middle cerebra artery：without craniotomy in rats[J].JStroke,1989,20：84 ～ 91.

[2]Koizumi J，Yoshid Y,Nakazawa T，et al.Experimental studies of is chemiabrainedema,a new experiment model of cerebral embolism in rats in which recirculation can be introduced in the ischemia area[J].J Stroke,1986,8：1.

[3]王蕊,楊秦飛,唐一鵬,等.大鼠擬VD模型的建立及中藥9602防治作用初探[J].北京中醫藥大學學報,2000,23(5）：30.

[4]孫云翔，栗錦遷.葛根素擴血管作用及其機制初探 [J].中草藥2002,33(8）：733 ～ 734.

[5]魏紅艷,張龔,賀風義,等.葛根素對冠心病患者血液流變學及血酯的影響[J].淮海醫藥,2003,21(5）：415.

[6]宋洪亮,陳士林,梅學仁,等.葛根素口服制劑抗心肌缺血及對心肌細胞的保護作用[J].中草藥,2003,34(12）：1104～1105.