P物質對哮喘大鼠神經內分泌功能的調節

董 榕，劉 悅，薛德彬，王月涵

(1.東南大學基礎醫學院生理學教研室，江蘇南京 210009;2.浙江寧波戒毒研究所，3.浙江寧波第四人民醫院，浙江寧波 315000)

哮喘是以氣道高反應性和氣流阻塞為特點的氣道慢性炎癥，其發病機制復雜，有多種炎性細胞、炎性因子參與［1，2］。目前引起氣道炎癥的機制主要有免疫源性炎癥與神經源性炎性介質學說［3］。大量的細胞因子及氣道感覺神經末梢釋放的神經肽類遞質都可以引起氣道平滑肌收縮、腺體分泌等，導致氣道高反應性。隨著研究的深入，哮喘的發病并不僅僅表現為肺部獨立器官的局部炎癥，而是涉及中樞神經系統，構成以腦活動為主的神經內分泌免疫調節網絡參與哮喘的發病過程［4］。P物質(substance P，SP)是廣泛存在于神經系統中肽類遞質，其在外周可作為神經源性炎癥介質引起氣道炎癥，在腦內則廣泛分布于30多個腦區。在大鼠延髓腹外側區注入SP，則能引起大鼠呼吸幅度增加，呼吸頻率減小。表明腦內SP能調控呼吸功能，但其對哮喘大鼠呼吸功能的調節作用報道甚少。故本實驗觀察腦內SP對哮喘活動的影響，并探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑與器材 P物質與受體拮抗劑［D-pro2，D-Trp7.9］-SubstanceP(S0145)，卵 蛋 白(Ovalbumin，OVA)均購自Sigma公司。Fos免疫組織化學試劑盒與SP放射免疫分析試劑盒購自北京中杉生物工程有限公司(進口分裝)。促腎上腺皮質激素釋放激素(corticotropin-releasing hormone，CRH)、促腎上腺皮質激素(adrenocorticotropic hormone，ACTH)、皮質酮(corticosterone，CORT)放射免疫分析試劑盒購自美國DSL公司。Powerlab生物信號處理系統均購自澳大利亞AD Instruments pty Ltd公司。

1.1.2 動物與分組 健康♂成年SD大鼠，體重300～400 g，清潔級，由江蘇省實驗動物中心提供［合格證號:(蘇)2008-0004］。大鼠隨即分成兩大組:(1)對照組:分為① 正常組(control，n=8)，大鼠不行任何手術，在安靜、溫暖(18～25℃)，避強光，晝夜光照節律(明暗周期為10/14)的實驗室飼養，自由飲水和攝食;②假手術組(sham，n=8)，大鼠在致敏吸入、靜脈激發階段及手術過程中僅進行操作，不涉及任何藥物;③ 生理鹽水組(NS，n=8)，大鼠在致敏、吸入激發和靜脈激發階段均以NS代替卵蛋白混懸液，腦內PVN注射NS 1 μl。(2)哮喘模型組:① Fos檢測組(OVA，n=8):哮喘模型大鼠行Fos免疫組織化學染色;② 模型對照組(OVA+NS，n=8):哮喘模型大鼠靜脈注射OVA激發哮喘發作后，大鼠PVN內微量注射NS 1 μl;③SP組(OVA+SP，n=8):哮喘大鼠靜脈注射OVA激發哮喘發作后，PVN 微量注射SP 8 μg(1 μl);④ S0145 組(OVA+S0145，n=8):哮喘大鼠 PVN 內注射 S0145 1 μg(1 μl)，再靜脈注射OVA激發哮喘發作;⑤ S0145+SP組(OVA+S0145+SP，n=8):哮喘大鼠靜脈注射OVA激發哮喘發作后，PVN內先用S0145 1 μg預處理，然后再微量注射SP 8 μg。

1.2 方法

1.2.1 制備哮喘大鼠模型 實驗d 1每只大鼠腹腔注射抗原致敏液1 ml，d 3再次腹腔注射抗原致敏液1 ml以強化，d 15～17用超聲霧化器霧化吸入0.01 g·ml－1卵蛋白生理鹽水溶液(2 ～3 ml·min－1，顆粒直徑≤5 μm)20 min，每天 1 次，連續霧化3 d。大鼠出現煩躁不安、呼吸急促、用力呼吸、呼吸困難、喘息、腹肌明顯收縮、咳嗽等哮喘癥狀。

1.2.2 PVN中樞立體定位術與核團微量注射 SD大鼠在戊巴比妥鈉(30～40 mg·kg－1，ip)麻醉下，固定于腦立體定位儀上，按照George Paxinos and Charles Watson圖譜，使切牙低于耳間線3.3 mm，以前囟為零點，PVN的坐標為 AP-1.8 mm，LR 0.2 mm，H-7.9 mm，在該處埋一外徑為0.4 mm，帶芯的不銹鋼管作為注射引導管，用牙托水泥和502膠固定，用外徑0.2 mm不銹鋼管作為注射管，注射管尖端露出0.5 mm，在靜脈注射OVA激發哮喘發作后，PVN內分別微量注射SP或SPR阻斷劑S0145，生理鹽水作為模型對照組(OVA+NS)，實驗中PVN內注射所用的 NS，SP，S0145均保持 pH:7.2～7.4，37℃，注射體積為 1 μl，注射速率為 1 μl·min－1，注射藥物后留管20 min。

實驗結束后，用相同給藥法在原點注射等體積美藍，常規切片后，對照大鼠腦立體定位圖譜確定注射部位是否準確。定位不準者，數據不納入統計。

1.2.3 放免法測定大鼠PVN內SP與正中隆起的CRH及血漿中ACTH與CORT含量 制備哮喘模型成功后(致敏后18 d)，取大鼠下丘腦室旁核，勻漿離心后取上清，放入－70℃冰箱保存，待測SP，NS組與模型各組(除Fos組)大鼠均在每日上午8∶00開始實驗，PVN處注射藥物30 min后，每日定時取樣:取正中隆起及尾靜脈采血，離心取上清置入－70℃冰箱保存，待測 CRH、ACTH、CORT。上述各組大鼠中PVN中SP，與正中隆起中CRH與血漿中ACTH、CORT的含量檢測均采用放射免疫分析方法，由東南大學放射免疫檢測中心完成。

1.2.4 取材 大鼠經0.4%戊巴比妥鈉(6 mg·kg－1，ip)麻醉后，用含 40 g·L－1多聚甲醛的 0.1 mol·L－1的PBS緩沖液常規經心臟灌流固定取材，后移入0.87 mol·L－1的蔗糖緩沖液中至標本沉降。恒冷箱冰凍連續冠狀切片(片厚30 μm)。切片收集在盛有0.01 mol·L－1PBS的切片盒中，按試劑盒要求及步驟進行染色。

1.2.5 Fos免疫組織化學染色 切片入正常山羊血清封閉液，室溫孵育20 min，勿洗。然后依次加入兔抗Fos血清(1∶300，Santa Cruz)室溫孵育30 min，隨后4℃孵育12 h，之后進入生物素標記的羊抗兔IgG及SAHRP，室溫孵育2 h，各步驟間均用PBS充分洗滌。繼之用DAB法室溫呈色，顯微鏡下控制反應時間，終止顯色后貼片，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片后鏡下觀察。陰性對照用PBS代替一抗，其它染色步驟同上。

1.2.6 免疫樣陽性細胞計數 將待測切片置于連接計算機的顯微鏡下(×100)，每張切片選取4個不同視野，用加拿大JD801圖像分析系統觀察計數，取該例動物各平面的平均數，即為該動物該核團的陽性細胞數，每組8個大鼠間再取平均值，即為該組大鼠該核團的免疫反應陽性細胞數。

1.2.7 肺功能測定 將麻醉大鼠連接呼吸流量換能器測定潮氣量(tidal volume，VT)。將食管內壓(intrapleural ppressure，IPP)代替胸內壓(thoracic pressure，PTH)。將雙鉑金引導電極插入大鼠膈肌片內引導膈肌肌電活動。記錄大鼠膈肌肌電，可準確記錄大鼠呼吸運動情況以及測算呼氣吸氣時程比。呼吸流量、食管內壓和膈肌肌電3種信號經PowerLab/400生物采集系統采集處理，得到以下指標:①膈肌肌電活動，包括膈肌放電頻率(frequency diaphragmatic electric activity，FDEA)和膈肌放電積分幅值(integrated diaphragmatic electric activity，IDEA);② 呼吸功能，包括呼氣/吸氣時程(expiration time/inspiration time，TE/TI)。氣道阻力(airway resistance，RAW)、肺順應性(lung compliance，CL)、每分鐘通氣量(minute ventitation volume，MVV)。大鼠呼吸穩定后先連續記錄30 min，注藥后再連續記錄60 min。

2 結果

2.1 哮喘急性發作時，大鼠下丘腦室旁核內Fos表達 光鏡下觀察哮喘時PVN內Fos蛋白的表達，正常組、假手術組和NS組大鼠PVN內均可見散在的Fos免疫反應陽性細胞分布，多為淺染，數量很少，且無密集分布區，組間無差別。哮喘發作后，PVN內Fos免疫反應陽性物質呈雙側分布，與正常組、假手術組和NS組的Fos表達數量在統計學上差異均有顯著性(P<0.01，Fig 1)。所有Fos陰性對照切片上均呈陰性反應。

Fig 1 Fos-positive cells in PVN of asthmatic ratsA:Normal control group;B:Sham-operated group;C:NS control group;D:Asthma group.bar=50 μm

2.2 哮喘模型大鼠PVN內SP含量變化 利用放射免疫分析法發現，生理鹽水對照組大鼠PVN內SP含量為(3.5±0.7)ng·g－1組織，哮喘模型組大鼠PVN內SP含量為(6.3±1.4)ng·g－1組織，表明哮喘發作時，大鼠下丘腦PVN內SP含量明顯增多(P<0.01)。

2.3 哮喘模型大鼠PVN內PVN微量注射SP和(或)SPR 阻斷劑 S0145、SP 對 CORT、ACTH、CRH含量的影響 利用放射免疫分析法測得哮喘模型大鼠下丘腦正中隆起內CRH，以及同一只動物的血液中ACTH與CORT均明顯降低，表明哮喘時HPA軸功能明顯下調，而SP組與模型對照組相比，血液中CORT及ACTH以及下丘腦正中隆起處CRH則進一步降低，而SP受體拮抗劑S0145組及S0145+SP組，CORT、ACTH與CRH含量均明顯增加(P<0.05)，表明SP受體拮抗劑可反轉SP的作用，使HPA軸功能上調(Tab 1)。

Tab 1 Effects of microinjection SP or/and S0145 intoPVN on HPA axis in asthmatic rats( ± s，n=8)

Tab 1 Effects of microinjection SP or/and S0145 intoPVN on HPA axis in asthmatic rats( ± s，n=8)

**P<0.01 vs control group;△P<0.05，△△P<0.01 vs OVA+NS group;▲P<0.05 vs OVA+SP group

Group CORT/μg·L －1 ACTH/ng·L －1 CRH/μg·L －1 Control 159.6±11.1 110.5±14.1 1.80±0.15 OVA+NS 101.7±15.6** 78.2±8.8** 1.48±0.18**OVA+SP 78.2± 6.5△△ 64.4±6.6△ 1.20±0.11△△OVA+S0145 143.7±14.1△△ 98.9±12.7△△ 1.68±0.13△OVA+S0145+SP 97.5±11.2▲ 76.2±10.1▲ 1.46±0.20▲

2.4 哮喘發作時，PVN微量注射SP和(或)SPR阻斷劑S0145對肺功能的影響 OVA+NS組與正常對照組比較，膈肌放電頻率(FDEA)、呼氣/吸氣時程比和氣道阻力增加;膈肌放電積分(IDEA)、每分鐘肺通氣量(MVV)、肺順應性減小(P<0.01)，表明哮喘大鼠具有肺通氣功能障礙。OVA+SP組與OVA+NS組比較，肺通氣障礙進一步增加，OVA+S0145組與OVA+NS組比較，反轉了腦內SP對肺通氣功能的影響。與正常對照組較為接近。OVA+S0145+SP組與OVA+NS組相比，各項肺功能指標差異均無顯著性。而與OVA+SP組比較，膈肌放電頻率(P<0.05)、呼/吸時程比(P<0.01)和氣道阻力(P<0.01)減少，膈肌放電積分(P<0.01)增加(Tab 2)。

Tab 2Effect of microinjection SP and/or S0145 into Paraventricular nucleus(PVN)on pulmonary function in asthmatic rats(±s，n=8)

Tab 2Effect of microinjection SP and/or S0145 into Paraventricular nucleus(PVN)on pulmonary function in asthmatic rats(±s，n=8)

FDEA:Frequency diaphragmatic electric activity;IDEA:Integrated diaphragmatic electric activity;MVV:Minute ventilation volume;CL:Lung compliance;RAW:Airway resistance;TE/TI:Expiration time/Inspiration time.**P<0.01 vs control group;△P<0.05，△△P<0.01 vs OVA+NS group;▲P<0.05，▲▲P<0.01 vs OVA+SP group

Group FDEA/n·min－1 IDEA/mV·s－1 MVV/ml·min －1 TE/TI RAW/cmH2O·ml－1·s－1 CL/ml/cmH2O Control 109.82±3.58 14.93±3.16 81.3008±6.52 1.61±0.13 0.35±0.03 0.54±0.03 OVA+NS 156.33±15.21**11.90±1.02**57.67±7.26** 2.14±0.24** 0.57±0.06** 0.39±0.04**OVA+SP 183.17±17.51△ 7.20±1.18△△ 47.33±4.17△ 3.50±0.33△△ 1.09±0.13△△ 0.14±0.02△△OVA+S0145 117.36±14.84△△ 14.47±1.00△△ 83.49±6.33△△ 1.59±0.17△△ 0.42±0.04△△ 0.49±0.06△△OVA+S0145+SP 160.32±15.52▲ 11.36±0.92▲▲ 56.21±8.38▲ 2.10±0.18▲▲ 0.58±0.07▲▲ 0.33±0.03▲▲

3 討論

P物質是由非腎上腺素能非膽堿能神經末梢所釋放的一種神經肽，作為一種最早發現的神經肽，除了在疼痛感覺上傳至相應腦區的傳遞過程中起重要作用外［5］，還具有調控血壓、呼吸、消化等多種生理功能。Mazzone等［6］研究發現在正常大鼠延髓孤束核區微量注射SP可引起潮氣量增加，呼吸頻率不變，神經解剖學研究亦發現，從延髓、腦橋有關呼吸調控的基本中樞，至下丘腦、皮層的高級整合中樞，由下至上的呼吸調控的機體結構中均含有SP及其受體的分布，提示中樞內SP與機體呼吸活動密切相關。本實驗中利用免疫組織化學實驗證實哮喘發作時，大鼠下丘腦室旁核神經元活動增強;電生理實驗亦證實，哮喘發生時，利用玻璃微電極引導大鼠室旁核神經元單位放電明顯增加(文章待發表);形態學與功能學的實驗結果均表明PVN的興奮與哮喘的發生密切相關。在外周組織中的氣管、支氣管和支配于肺的感覺c-纖維神經末梢，SP則作為一種神經源性炎癥介質收縮氣道平滑肌，增加微血管通透性，激活炎性細胞，引起哮喘氣道的神經源性炎癥的發生。放射免疫分析法檢測在哮喘發生時PVN內SP含量明顯升高，給予SP受體拮抗劑后，哮喘癥狀明顯減輕，而給予外源性SP時，哮喘癥狀則進一步惡化，提示作為調控內臟功能的高級整合中樞，下丘腦室旁核內SP遞質參與哮喘的發生發展。近年來有關哮喘的研究發現:外周的免疫源性炎性改變在腦組織內也同樣發生，即腦內也出現了與外周同樣的細胞因子改變［7］，那么PVN內SP的變化也可能提示外周的神經源性炎癥改變也在腦內出現，引起了腦內炎性反應，可稱之為中樞致敏狀態。室旁核與延髓呼吸調控中樞有密切的往返聯系，哮喘發生時，室旁核內神經元興奮，沖動可經延髓呼吸基本中樞反射性地調控外周氣道的高反應性，影響哮喘的發生發展過程。

哮喘屬于應激反應，機體可通過HPA軸分泌激素，來調節并完成對應激的適應。本實驗中，采用同一種檢測方法(放免法)在同一個體上檢測了下丘腦－垂體－腎上腺皮質3個平面的激素分泌情況，并使動物在安靜、避強光、明暗周期10/14，溫度18～25℃，定時定量喂養的實驗環境條件下，每天定時取血與組織，盡量排除了影響HPA軸活動的干擾因素，保證結果可信度。大多數應激伴有HPA軸的激活，糖皮質激素的增加，而在本實驗中則可見哮喘發生時HPA軸受到抑制，臨床上亦可見到哮喘病人腎上腺皮質功能低下的這類現象，但機制不清。故以激素治療哮喘是普遍實施的治療方法［8］。下丘腦室旁核是神經內分泌免疫網絡調節的高級整合中樞，HPA軸的活動是神經內分泌的典型代表，Jeppop等［9］曾報道大鼠腦內SP可通過抑制HPA軸活動引起外周血中ACTH與CORT含量下降，而在下丘腦室旁核與正中隆起處均有SP及其受體分布，在哮喘發生時，隨著PVN內SP含量增加，HPA軸功能下調導致ACTH與CORT血中濃度下降，抗炎作用減弱，哮喘癥狀進一步惡化，而給予SP受體拮抗劑預先干預后，上調了HPA軸活動，隨著CRH-ACTH-CORT的激素水平升高，哮喘癥狀亦隨之明顯好轉，表明哮喘大鼠下丘腦室旁核內肽類遞質SP不僅可以通過延髓等腦區反射地調控氣道與肺的活動，也可通過調控HPA軸活動來影響外周氣道高反應性。SP作用于PVN內合成CRH的神經內分泌細胞，抑制CRH的合成與分泌［10］，引起下游激素 ACTH與CORT合成分泌減少，導致CORT的抗炎作用減弱，加重哮喘。因此下丘腦室旁核內SP通過調控神經內分泌系統來影響氣道炎癥反應可能是哮喘病理發生過程中的一種重要環節。

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