姜黃素對大鼠缺血性腦損傷炎癥反應和血腦屏障通透性的影響

雷軍榮，秦 軍，張 晶，黃寬明，付 銳，周章明

(鄖陽醫學院附屬太和醫院，湖北十堰 442000)

腦血管病是危害人類生命和健康的常見病。腦缺血損傷所涉及的病理生理機制十分復雜，其中，炎癥反應和血腦屏障破壞均是缺血性腦損傷的重要病理生理機制［1］。研究表明［2］腫瘤壞死因子-α(TNF-α)在腦缺血誘導的炎癥反應中起著重要的作用;基質金屬蛋白酶-9(MMP-9)在腦缺血誘導的血腦屏障破壞中起著重要的作用［3］。國內外研究［4，5］證實姜黃素對腦缺血損傷具有腦保護作用，但是姜黃素對炎癥反應和TNF-α作用的相關研究較少，本實驗對姜黃素影響血腦屏障通透性和MMP-9表達進行了初步的研究。

1 材料與方法

1.1 藥物和主要試劑 姜黃素，購自美國Sigma公司，分子量 368.38，用 0.5 mol·L－1NaOH 溶解，然后立即用PBS稀釋成100 g·L－1，儲存于－20℃，用時根據需要量再進行稀釋。

伊文思藍染料和TTC染料購自美國Amersco公司。MPO檢測試劑盒購自南京建成生物技術公司。TNF-α ELISA試劑盒購自美國RD公司。兔抗大鼠MMP-9多克隆抗體購自美國 Santa Cruz公司。Western blot試劑盒購自美國KPL公司。

1.2 動物分組及腦缺血模型的制備 ♂清潔級Sprague-Dawley大鼠，體重(250±20)g，由上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供［許可證號:SCXK(滬)2003－0003］。隨機將大鼠分為4個組，即假手術組、溶媒組、姜黃素10 mg·kg－1組和姜黃素50 mg·kg－1組。腦缺血2 h后，經腹腔注射給予藥物或溶媒(PBS)，只給1次。

根據Longa線栓法［6］加以改進，采用直徑0.32 mm的尼龍魚線，10%水合氯醛(0.3 ml/100 g)腹腔注射麻醉，鈍性分離右側頸總動脈(CCA)、頸外動脈(ECA)、頸內動脈(ICA)，結扎頸外動脈。在頸外動脈近分叉處剪一“V”形切口，插入備用魚線，用鑷子輕輕將栓線送至大腦中動脈起始處，平均進線18.0±2.0 mm(距離頸總動脈分叉點)，固定栓線，2 h后拔除栓線制備再灌注損傷模型。假手術組只分離血管，不插入尼龍線。

1.3 神經功能損傷評分 根據文獻報道的神經功能損傷評分方法［7］，對腦缺血后24 h的大鼠進行神經功能評分。沒有神經功能障礙者，0分;提起大鼠尾巴對側前肢屈曲者，1分;行走時地上打轉，靜止時身體無偏向對側者，2分;行走時地上打轉，靜止時身體也偏向對側者，3分;嚴重意識障礙者，4分。

1.4 腦梗死體積測定 腦缺血后24 h，處死大鼠，快速取出大腦，沿冠狀面將大腦進行切片，每片厚度2 mm，放在2%TTC溶液中避光孵育20 min。孵育完畢后，將腦片置10%福爾馬林中固定24 h。正常腦組織呈鮮紅色，梗死腦組織呈白色。利用IPP軟件測量各腦片梗死面積，并計算整個大腦梗死體積。

1.5 測定中性粒細胞浸潤腦組織的程度 髓過氧化物酶(MPO)是中性粒細胞的標志性物質，通過檢測MPO的活性可知中性粒細胞的浸潤程度。在相應缺血時點取大鼠缺血腦組織，勻漿，按試劑盒說明書步驟操作，并計算MPO活性。

1.6 大腦伊文思藍含量測定 腦缺血23 h后，經股靜脈注射2%伊文思藍溶液1 ml，數秒鐘后可見大鼠眼睛、皮膚變成藍色。1 h后，處死大鼠，取出大腦，將缺血側大腦組織勻漿，置于50%三氯醋酸，混勻，放置24 h，測定620 nm處OD值。同時測定已知濃度的梯度伊文思藍溶液的OD值，并繪制標準曲線。根據標準曲線計算出待側樣品的伊文思藍含量。

1.7 ELISA檢測大腦TNF-α的含量 在相應缺血時點取大鼠缺血腦組織，勻漿。將標準蛋白樣品和待側樣品加入包被好一抗的96孔板，按試劑盒說明書步驟操作，最后測定450 nm波長處的OD值。根據已知濃度的標準蛋白的OD值繪制標準曲線，并根據標準曲線計算各待測樣品的TNF-α含量。

1.8 Western blot檢測腦組織MMP-9的表達水平

在相應缺血時點，取大鼠缺血腦組織100 mg加入到1 ml蛋白裂解液，勻漿，離心提取總蛋白，并測定蛋白濃度。經灌膠、上樣、10%聚丙烯酰胺凝膠電泳、轉膜、封閉等步驟后，加入一抗(兔抗大鼠MMP-9多克隆抗體、鼠抗大鼠β-actin單克隆抗體)，4℃孵育過夜，加入相應二抗，室溫孵育2 h，再經顯影、定影、圖像采集等，用Quantity one軟件分析蛋白條帶。

2 結果

2.1 姜黃素對大鼠腦缺血神經功能損傷和腦梗死體積的作用 假手術組大鼠神經功能無損傷，腦缺血/再灌注損傷24 h大鼠神經功能損傷評分增高(2.1 ±0.6，P<0.01)，姜黃素 50 mg·kg－1治療組減輕大鼠腦缺血/再灌注誘導的神經功能損傷(1.5±0.3，P<0.5)，而姜黃素 10 mg·kg－1則無明顯作用(1.9±0.4，P>0.05)。

假手術組未見腦梗死，腦缺血/再灌注損傷24 h大鼠腦梗死體積明顯增大(186.47±13.2 mm3，P<0.01)，姜黃素10 mg·kg－1治療組腦梗死體積(157±10.7 mm3，P<0.05)和 50 mg·kg－1治療組腦梗死體積(145.83±8.63 mm3，P<0.01)均小于溶媒組腦梗死體積，姜黃素50 mg·kg－1治療組腦梗死體積小于姜黃素10 mg·kg－1治療組(P<0.05)。

2.2 姜黃素對大鼠腦缺血中性粒細胞浸潤的抑制作用 大鼠腦缺血/再灌注損傷24 h，缺血腦組織MPO活性明顯增高，姜黃素10 mg·kg－1和50 mg·kg－1治療組均可減輕缺血腦組織MPO的活性，即抑制腦組織中性粒細胞的浸潤，且姜黃素50 mg·kg－1治療組對中性粒細胞的抑制作用明顯大于姜黃素 10 mg·kg－1治療組(Tab 1)。

Tab 1 Effect of curcumin on the MPO activity and evans blue(EB)content in ischemic brain following cerebral ischemia/reperfusion in rats(±s，n=8)

Tab 1 Effect of curcumin on the MPO activity and evans blue(EB)content in ischemic brain following cerebral ischemia/reperfusion in rats(±s，n=8)

#P<0.05，##P<0.01 vs sham;*P<0.05，**P<0.01 vs vehicle;△P<0.05，△△P<0.01 vs curcumin 10 mg·kg－1

Group MPO activity/U·g－1tissue EB content/μg·g－1tissue Sham 0.15±0.034 3.24±0.53 Vehicle 0.47±0.056## 14.52±2.46##Curcumin 10 mg·kg－1 0.38±0.083*## 13.74±2.58##Curcumin 50 mg·kg－1 0.32±0.061**#△ 8.67±1.58**#△△

2.3 姜黃素改善大鼠腦缺血后血腦屏障的完整性大鼠腦缺血/再灌注損傷24 h，缺血腦組織伊文思藍含量明顯增高，表明血腦屏障通透性增高、完整性破壞。姜黃素50 mg·kg－1治療組明顯減輕缺血腦組織伊文思藍的含量，即姜黃素50 mg·kg－1可明顯減輕腦缺血誘導的血腦屏障破壞;而姜黃素10 mg·kg－1治療組對血腦屏障的通透性無明顯作用(Tab 1)。

2.4 姜黃素減少大鼠缺血腦組織TNF-α的含量大鼠腦缺血/再灌注損傷24 h，缺血腦組織TNF-α的含量明顯增高。姜黃素10 mg·kg－1和50 mg·kg－1治療組均可減輕缺血腦組織TNF-α的含量，且姜黃素50 mg·kg－1治療組對TNF-α的抑制作用大于姜黃素10 mg·kg治療組(Fig 1)。

Fig 1 Effect of curcumin on the content of inflammatory factorTNF-α in rat brain after cerebral ischemia(±s，n=8)

2.5 姜黃素降低大鼠缺血腦組織MMP-9的表達水平 大鼠腦缺血/再灌注損傷24 h，缺血腦組織MMP-9的蛋白表達明顯增高。姜黃素50 mg·kg－1治療組明顯降低缺血腦組織MMP-9的蛋白表達水平，而姜黃素10 mg·kg－1治療組對缺血腦組織MMP-9的蛋白表達水平無明顯抑制作用(Fig 2)。

Fig 2 Effect of curcumin on the expression of MMP-9 in rat brain after cerebral ischemia(±s，n=8)

3 討論

姜黃素是一種從姜黃屬藥用植物中提取的黃顏色多酚物質。實驗證明，姜黃素具有多種生物學功能，包括抗腫瘤［8］、抗氧化和抗炎癥［9］等作用。近年來，國內外學者發現姜黃素可以減輕缺血性腦損傷，對腦缺血起保護作用。Zhao等［4］發現姜黃素可以通過抑制Caspase的表達，減輕神經元凋亡。周瑞等［5］利用大鼠全腦短暫性缺血模型，證實姜黃素可以通過降低N-甲基-D-天門冬氨酸受體亞單位(NR2A)的表達和增加NR2B的表達，進一步抑制海馬區神經元凋亡，從而起神經保護作用。

我們的實驗通過建立大鼠腦缺血/再灌注模型，首先證實了姜黃素具有減輕腦缺血神經功能損傷和腦梗死體積的作用，即姜黃素對大鼠腦缺血具有神經保護作用，且姜黃素50 mg·kg－1劑量組的保護作用更為明顯。隨后為了進一步研究姜黃素腦保護作用的機制，我們檢測了MPO在缺血腦組織中的活性，結果顯示腦缺血后MPO活性明顯升高，而姜黃素 10 mg·kg－1組和 50 mg·kg－1組均可減輕 MPO的活性。因為MPO反映中性粒細胞浸潤腦組織的程度，同時也反映腦組織炎癥反應的程度［10］，所以姜黃素可明顯減輕腦缺血的炎癥反應。因此，我們也可以推測姜黃素通過減輕炎癥反應，進一步減輕缺血性腦損傷。TNF-α是一種誘導炎癥反應重要的細胞因子，本實驗結果還證實了姜黃素10 mg·kg－1組和 50 mg·kg－1組均可減少腦組織 TNF-α 的含量，這充分說明了姜黃素對炎癥反應的抑制作用，也進一步證明了姜黃素通過減輕炎癥因子和炎癥反應而減輕缺血性腦損傷。

血腦屏障的破壞是缺血性腦損傷的重要病理生理機制之一。腦缺血后炎癥反應和炎癥因子的釋放可以增加血腦屏障通透性，而血腦屏障通透性的增加又可以進一步增加血液中白細胞在缺血腦組織中的浸潤，從而加重炎癥反應［11，12］。MMP-9 是一種可以降解血腦屏障基底膜的酶類物質，其表達量和活性的增高可促進血腦屏障通透性的增高［3，11］。我們的實驗發現姜黃素50 mg·kg－1組可以明顯減輕腦缺血誘導的血腦屏障破壞，此外姜黃素50 mg·kg－1組還可以降低缺血腦組織MMP-9的蛋白表達量，而姜黃素10 mg·kg－1組不能減輕血腦屏障破壞和MMP-9的表達。因此，我們推測姜黃素是通過降低MMP-9的表達改善血腦屏障的完整性，從而減輕缺血性腦損傷。

綜上所述，姜黃素可以減輕大鼠缺血性腦損傷。姜黃素抑制TNF-α的釋放和炎癥反應、減輕MMP-9的表達和改善血腦屏障的完整性可能是姜黃素減輕缺血性腦損傷的機制之一。姜黃素作為一種無毒、價格低廉的物質，有望成為新型的抗缺血性腦中風的治療藥物。

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