黃芪注射液抑制缺氧缺糖/復氧復糖大鼠海馬神經(jīng)元JNK3的表達

葉冬青，高維娟，錢 濤，閆鳳霞，張雅麗，侯志平

隨著現(xiàn)代醫(yī)學的發(fā)展，人口老齡化進程加快，缺血性腦血管病的發(fā)病率逐年升高，而缺血/再灌注損傷(ischemia-reperfusion injury，IRI)是缺血性腦血管病發(fā)病的重要病理生理過程。大腦是對缺血缺氧十分敏感的組織，而海馬則是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中對缺氧耐受相對較差的部位，故腦海馬神經(jīng)元常被用來作為缺血缺氧損傷研究的模型［1］。在缺血性腦血管疾病的發(fā)生發(fā)展過程中，細胞凋亡是神經(jīng)元損傷的發(fā)生機制之一，其中凋亡相關(guān)基因c-Jun氨基末端激酶3(c-Jun N terminal kinase 3，JNK3)的表達與神經(jīng)元凋亡關(guān)系十分密切［2］。黃芪注射液為臨床治療缺血性腦血管病的常用藥物，可抑制細胞凋亡的發(fā)生［3］。本課題組前期實驗證實，黃芪注射液可抑制全腦缺血/再灌注大鼠海馬神經(jīng)元凋亡，并且對離體培養(yǎng)的缺氧缺糖/復氧復糖大鼠海馬神經(jīng)元凋亡有抑制作用，但是通過哪條信號傳導通路發(fā)揮抑制凋亡作用目前尚不清楚。本研究通過觀察黃芪注射液對缺氧缺糖/復氧復糖大鼠海馬神經(jīng)元凋亡相關(guān)蛋白JNK3及其mRNA表達的影響，探討黃芪注射液抑制細胞凋亡的分子機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 SD大鼠，新生(1～2)d，♀♂兼有，二級動物，由河北省實驗動物中心提供，合格證號:冀醫(yī)動字第702003號。

1.1.2 試劑和儀器 兔抗磷酸化JNK3多克隆抗體購于美國Ebioscience公司;BCA蛋白定量試劑盒購于上海申能博彩生物公司;JNK3 RT-PCR引物是由上海生物工程有限公司設計，RT-PCR試劑盒購自大連寶生物公司;多聚賴氨酸、阿糖胞苷購自美國Sigma公司;胎牛血清、馬血清由Hyclone公司生產(chǎn);谷氨酰胺、胰蛋白酶購自華美生物工程公司;DMEM/F12培養(yǎng)基、B27由美國Gibco公司生產(chǎn);NSE免疫組化染色試劑盒購自北京中杉金橋公司;黃芪注射液由成都地奧九泓制藥廠生產(chǎn);其他試劑為國產(chǎn)分析純。主要儀器:HERA cell 150型CO2培養(yǎng)箱由德國Heraeus公司生產(chǎn);LEICA DMIL 090-135.001型倒置顯微鏡由德國Wetzlar GmbH公司生產(chǎn);TDL-40B離心機由上海安亭科學儀器制造廠生產(chǎn);DYY-6B型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀購自北京六一儀器廠;MK3型酶標儀購自上海雷勃公司。

1.2 方法

1.2.1 海馬神經(jīng)細胞的分離、培養(yǎng)及鑒定 培養(yǎng)方法參照Brewer的方法并做少許改良［4］。取新生24 h內(nèi)的SD大鼠海馬組織，6.25 mmol·L－1的胰蛋白酶消化，馬血清終止消化后將組織塊混合液移入離心管，加 D-Hanks液1 000 r·min－1離心 5 min，去上清后加DMEM/F12溶液7 ml，吹打離散組織，制成細胞懸液，以200目濾網(wǎng)過濾。取細胞懸液在100倍倒置顯微鏡下計數(shù)，以5×108·L－1密度接種在含有種植培養(yǎng)液(DMEM/F12培養(yǎng)基添加0.012 mol·L－1胎牛血清，0.014 mol·L－1馬血清，0.1 g·L－1谷氨酰胺，0.1 U·L－1青霉素和 0.1 g·L－1鏈霉素)的培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶中。d 2用無血清培養(yǎng)液(DMEM/F12添加0.02 mol·L－1B27)代替種植液。d 4換液時添加0.005 g·L－1阿糖胞苷以抑制膠質(zhì)細胞生長，24 h后替換成新鮮無血清培養(yǎng)液。培養(yǎng)8 d后用NSE免疫組化染色法進行神經(jīng)元純度鑒定。

1.2.2 缺氧缺糖/復氧復糖細胞模型的建立與實驗分組 把原代培養(yǎng)8 d的大鼠海馬神經(jīng)元隨機分為4組:正常對照組、缺氧缺糖/復氧復糖組(模型組)、黃芪注射液組和黃芪溶劑對照組。除正常對照組外均參照 Bossenmeyer等［5］的方法建立缺氧缺糖/復氧復糖細胞模型:取培養(yǎng)8 d的海馬神經(jīng)元用無糖Earle′s代替培養(yǎng)液，隨即把培養(yǎng)皿(瓶)置于37℃溫箱中的缺氧裝置里，快速通入高純氮氣1 min，再使氣體勻速緩慢連續(xù)排出。缺氧缺糖30 min后，換正常無血清培養(yǎng)液繼續(xù)在37℃，5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。正常對照組正常培養(yǎng)，不進行任何處理;黃芪注射液組于缺氧缺糖時加入黃芪注射液［0.5 g(生藥)·L－1］［6］，直至培養(yǎng)結(jié)束;黃芪溶劑對照組處理方法與黃芪注射液組相同，只是將黃芪注射液換為pH值7.4的等量黃芪溶劑即無菌去離子水。

各組在復氧復糖后 0、0.5、2、6、24、72 和 120 h觀察JNK3蛋白及其mRNA的表達。

1.2.3 蛋白免疫印跡法檢測細胞內(nèi)JNK3的表達收集細胞，提取胞質(zhì)蛋白，用BCA法進行蛋白定量。取40 μg樣品，加入蛋白體積1/4的 loading Buffer緩沖液混勻，在100℃沸水中煮7 min，以12%SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，分離的蛋白用半干電轉(zhuǎn)移法轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，4℃封閉過夜后加入用封閉液稀釋的兔抗磷酸化JNK3多克隆抗體(1∶200稀釋)室溫放置2 h。洗膜液洗3×10 min，用生物素標記的二抗(1∶14 000稀釋)孵育1 h，洗膜液洗后用化學發(fā)光法顯色，X射線底片曝光。以β-actin為內(nèi)參照。實驗重復6次，目的條帶為54 ku。用Quantity one軟件對各時間點蛋白條帶平均光密度值進行分析。

1.2.4 酶聯(lián)免疫法檢測缺氧缺糖/復氧復糖海馬神經(jīng)元JNK3的活性 收集細胞，用細胞裂解液裂解、震蕩，用1 000×g離心20 min后取上清液，用樣品稀釋液將標準品稀釋，各濃度標準品均以100 μl加入孔中?？瞻卓准尤?00 μl樣品稀釋液。將酶標板放入37℃溫箱中反應120 min。反應后棄去液體加入檢測溶液A 工作液100 μl，37℃，60 min溫育后棄去液體，洗板3×2 min，甩干后加入檢測溶液B工作液100 μl，37℃，60 min。甩干后洗板5 ×2 min。甩干后依序加入底物溶液90 μl，37℃避光顯色25 min，終止顯色后用酶聯(lián)儀在450 nm波長測量各加樣孔OD值，實驗重復6次。

1.2.5 RT-PCR檢測細胞內(nèi)JNK3 mRNA的表達收集細胞，用TRIzol一步法提取RNA，按ExscriptTMRT reagent kit說明逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。JNK3 cDNA引物序列上游 5′-CCACGCAGATCAAACAGGA-3′，下游5′-GCCAACCGCTCAGCATAA-3′，擴增片段長度為821 bp;內(nèi)參照 β-actin引物序列上游 5′-GGACTTCGAGCAAGAGATGG-3′，下 游 5′-ACATCTGCTGGAAGGTGGAC-3′，擴增片段長度為509 bp。按照PCR Amplification kit說明進行反應，擴增條件:95℃預變性3 min;94℃ 40 s;54℃ 40 s;72℃ 40 s，循環(huán)30次;最后于72℃延伸3 min。用1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物，實驗重復6次。用凝膠分析軟件Quantity one進行定量分析，目的條帶在800 bp。

Tab 1 The effect of astragalus injection on the ratio of mean optic density(MOD)of expression of JNK3 protein and β-actin after hypoxia/hypoglycemia and reoxygenation in hippocampal neurons of rats(±s，n=6)

Tab 1 The effect of astragalus injection on the ratio of mean optic density(MOD)of expression of JNK3 protein and β-actin after hypoxia/hypoglycemia and reoxygenation in hippocampal neurons of rats(±s，n=6)

Normal:Normal control group;Original:Original astragalus injection group;Model:Hypoxia/hypoglycemia and reoxygenation group;Astragalus:Astragalus injection group.*P<0.05 vs normal;#P<0.05 vs model and original

Group The time of hypoxia/hypoglycemia and reoxyge nation 0 h 0.5 h 2 h 6 h 24 h 72 h 120 h Normal 0.448±0.06 0.448±0.06 0.448±0.06 0.448±0.06 0.448±0.06 0.448±0.06 0.448±0.06 Original 0.538±0.07* 0.637±0.05* 0.709±0.05* 0.758±0.09* 0.627±0.09* 0.531±0.06* 0.389±0.11*Model 0.542±0.06* 0.639±0.04* 0.705±0.07* 0.765±0.06* 0.631±0.05* 0.536±0.08* 0.384±0.07*Astragalus 0.442±0.05# 0.526±0.04# 0.59±0.05# 0.658±0.04# 0.561±0.06# 0.478±0.03#0.386±0.03

Tab 2 The effect of astragalus injection on OD value of the activity of JNK3 protein after hypoxia/hypoglycemia and reoxygenation in hippocampal neurons of rats ± s，n=6)

Tab 2 The effect of astragalus injection on OD value of the activity of JNK3 protein after hypoxia/hypoglycemia and reoxygenation in hippocampal neurons of rats ± s，n=6)

Note see Tab 1.*P<0.05 vs normal;#P<0.05 vs model and original

Group The time of hypoxia/hypoglycemia and reoxyge nation 0 h 0.5 h 2 h 6 h 24 h 72 h 120 h Normal 0.368±0.07 0.368±0.07 0.368±0.07 0.368±0.07 0.368±0.07 0.368±0.07 0.368±0.07 Original 0.57±0.08* 0.605±0.04* 0.70±0.04* 0.891±0.07* 0.726±0.03* 0.659±0.03* 0.259±0.09*Model 0.58±0.09* 0.608±0.05* 0.71±0.04* 0.894±0.05* 0.729±0.02* 0.662±0.03* 0.261±0.1*Astragalus 0.466±0.07# 0.501±0.06# 0.628±0.05# 0.759±0.05# 0.642±0.05# 0.605±0.06#0.263±0.12

2 結(jié)果

2.1 海馬神經(jīng)元原代培養(yǎng)形態(tài)和純度 NSE免疫組化染色結(jié)果顯示:無血清培養(yǎng)8 d的海馬神經(jīng)元胞體飽滿，突起明顯、突起末端分支形成神經(jīng)網(wǎng)絡，相互支持生長，神經(jīng)膠質(zhì)細胞少見，3個400倍視野中陽性神經(jīng)細胞的數(shù)目為68個，純度為(91.48±0.72)%，見 Fig 1。

Fig 1 Hippocampal neurons stained with NSE(×400)

2.2 黃芪注射液對缺氧缺糖/復氧復糖大鼠海馬神經(jīng)元JNK3蛋白表達的影響 Western blot實驗結(jié)果顯示:與正常對照組相比，模型組在復氧復糖后0、0.5、2、6、24 和 72 h 海馬神經(jīng)元 JNK3 蛋白條帶平均光密度值均增加(P<0.05)，復氧復糖120 h JNK3蛋白條帶平均光密度值降低(P<0.05)。與模型組相比，黃芪注射液組除復氧復糖120 h外各時間段JNK3蛋白條帶平均光密度均降低(P<0.05)，而黃芪溶劑對照組則差異無顯著性(P>0.05)，見 Tab 1，F(xiàn)ig 2。

Fig 2 The effect of astragalus injection on expressionof JNK3 protein after hypoxia/hypoglycemia and

2.3 黃芪注射液對缺糖缺氧/復糖復氧大鼠海馬神經(jīng)元JNK3活性的影響 ELISA實驗結(jié)果顯示:與正常對照組相比，模型組在復氧復糖后0、0.5、2、6、24和72 h海馬神經(jīng)元JNK3蛋白濃度及其活性OD值均增加(P<0.05)，復氧復糖120 h JNK3蛋白濃度及其活性OD值降低(P<0.05)。與模型組相比，黃芪注射液組除復氧復糖120 h外各時間段JNK3蛋白濃度及其活性OD值均降低(P<0.05)，而黃芪溶劑對照組則差異無顯著性(P>0.05)。見Tab 2、3。

Tab 3 The effect of astragalus injection on the concentration of JNK3 protein after hypoxia/hypoglycemia andreoxygenation in hippocampal neurons of rats(mg·L －1，n=6)

Tab 4 The effect of astragalus injection on the ratio of mean optic density(MOD)of expression of JNK3 mRNA and β-actin after hypoxia/hypoglycemia and reoxygenation in hippocampal neurons of rats(ˉ±s，n=6)

Tab 4 The effect of astragalus injection on the ratio of mean optic density(MOD)of expression of JNK3 mRNA and β-actin after hypoxia/hypoglycemia and reoxygenation in hippocampal neurons of rats(ˉ±s，n=6)

Note see Tab 1.*P<0.05 vs normal;#P<0.05 vs model and original

Group The time of hypoxia/hypoglycemia and reoxyge nation 0 h 0.5 h 2 h 6 h 24 h 72 h 120 h Normal 0.468±0.04 0.468±0.04 0.468±0.04 0.468±0.04 0.468±0.04 0.468±0.04 0.468±0.04 Original 0.578±0.07* 0.637±0.06* 0.712±0.05* 0.759±0.07* 0.631±0.08* 0.603±0.12* 0.542±0.11*Model 0.586±0.06* 0.642±0.05* 0.702±0.06* 0.767±0.07* 0.638±0.07* 0.596±0.09* 0.539±0.11*Astragalus 0.452±0.05# 0.534±0.03# 0.62±0.03# 0.662±0.05# 0.567±0.07# 0.554±0.07#0.538±0.09

2.4 黃芪注射液對缺氧缺糖/復氧復糖大鼠海馬神經(jīng)元JNK3 mRNA表達的影響 RT-PCR結(jié)果顯示:與正常對照組相比，模型組大鼠在復氧復糖后0、0.5、2、6、24、72 和 120 h 海馬神經(jīng)元 JNK3 mRNA條帶密度均有所增強，其平均光密度值均明顯增加(P<0.05);與模型組相比，黃芪注射液組除復氧復糖120 h外各時間段JNK3 mRNA條帶平均光密度均降低(P<0.05)，而黃芪溶劑對照組則差異無顯著性(P>0.05)，見 Tab 4，F(xiàn)ig 3。

3 討論

Fig 3 The effect of astragalus injection on expression of JNK3mRNA after hypoxia/hypoglycemia and reoxygenation in hippocampal neurons of rats.RT-PCR of JNK3 mRNA

腦血管疾病是臨床常見病，其中缺血性腦血管病占絕大部分［7］。腦缺血后的再灌注損傷是缺血性腦血管病發(fā)病的重要病理生理環(huán)節(jié)，主要通過誘導細胞凋亡導致神經(jīng)元死亡［7］。缺氧缺糖/復氧復糖所致的神經(jīng)細胞損傷是腦缺血/再灌注損傷主要表現(xiàn)形式之一。研究表明［8］，神經(jīng)細胞缺氧缺糖/復氧復糖后常常發(fā)生細胞凋亡。

MAPK信號通路是缺氧缺糖/復氧復糖后神經(jīng)元凋亡發(fā)生的重要環(huán)節(jié)，JNK3是引發(fā)MAPK信號通路下游信號及神經(jīng)細胞凋亡相關(guān)基因表達的關(guān)鍵，抑制JNK的活性可以抑制神經(jīng)元的凋亡［9］。JNK家族是一類絲氨酸/蘇氨酸激酶，是哺乳動物內(nèi)發(fā)現(xiàn)的第三類MAPK(mitogen-activated protein kinases)家族［10］。JNK3是它的一個亞型，主要表達于腦組織［11］。在鈣離子超載、氧自由基等應激刺激下，表達于細胞質(zhì)的JNK3被磷酸化而激活后逐漸轉(zhuǎn)移到細胞核內(nèi)，調(diào)節(jié)c-jun等凋亡相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子。JNK可調(diào)控ATF2內(nèi)在的組蛋白乙?；D(zhuǎn)移酶活性和泛素介導的AP-1蛋白降解［12］，提高轉(zhuǎn)錄因子的穩(wěn)定性，從而引發(fā)JNK下游底物caspase等的凋亡級聯(lián)反應［13］。

中醫(yī)認為［14］，黃芪具有補氣生陽、益氣固表、抗毒生肌之功能。藥理學研究表明［14，15］，黃芪能明顯提高腦缺血/再灌注鼠腦組織內(nèi)超氧化物歧化酶(SOD)、一氧化氮合酶(NOS)和一氧化氮(NO)含量，清除氧自由基，增加微循環(huán)灌注，從而有效對抗腦缺血/再灌注損傷［15］。趙燕玲等［16］研究表明黃芪能減少大鼠腦缺血/再灌注后的神經(jīng)元凋亡。黃芪注射液臨床應用廣泛，每1 ml相當于生藥2 g，姚晨玲等［17］的研究證明黃芪注射液對體外培養(yǎng)的神經(jīng)細胞去血清損傷有保護作用。本實驗前期實驗通過MTT法證實加入終濃度為0.5 g(生藥)·L－1黃芪注射液對神經(jīng)元的保護作用最佳［6］。

本實驗以大鼠海馬神經(jīng)元原代培養(yǎng)為基礎(chǔ)，通過對培養(yǎng)細胞施加缺氧缺糖/復氧復糖因素來模擬腦缺血/再灌注病理生理過程，建立腦缺血/再灌注的細胞模型，從蛋白和基因水平觀察黃芪注射液對缺氧缺糖/復氧復糖大鼠海馬神經(jīng)元JNK3表達的影響。實驗證實:缺氧缺糖/復氧復糖組JNK3表達明顯增強，結(jié)合本課題組前期實驗觀察到缺氧缺糖/復氧復糖可使大鼠海馬神經(jīng)元凋亡現(xiàn)象［6］，推測缺氧缺糖/復氧復糖可通過增加JNK3蛋白及其mRNA表達而誘發(fā)神經(jīng)元凋亡。黃芪注射液可明顯降低缺氧缺糖/復氧復糖后 0、0.5、2、6、24、72 h 各時間點JNK3蛋白及其mRNA的平均光密度值(P<0.05)，同時使其蛋白活性OD值明顯降低。表明黃芪注射液可抑制缺氧缺糖/復氧復糖大鼠海馬神經(jīng)元凋亡相關(guān)基因JNK3 mRNA表達，從而抑制JNK3蛋白表達，降低了JNK3蛋白活性，從而抑制缺氧缺糖/復氧復糖大鼠海馬神經(jīng)元的凋亡。

本實驗觀察到缺氧缺糖/復氧復糖后120 h JNK3的表達與正常組相比差異無顯著性，推測可能是由于磷酸化的JNK3半衰期為48 h［18］，復氧復糖72 h后已表達的JNK3蛋白開始大量降解造成的。

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