熱休克蛋白90在硫化氫保護PC12細胞對抗化學性缺氧損傷中的作用

孟金蘭，蘭愛平，楊春濤，楊戰利，王立偉，陳麗新，朱琳燕，陳培熹，馮鑒強

近年的研究表明［1］，硫化氫(hydrogen sulfide，H2S)作為一種新型的氣體信號分子，不僅具有神經調質的作用，而且也被視為一種重要的生理性保護成分，具有廣泛的生物學效應。H2S不僅可保護鼠大腦皮層神經元對抗氧化應激的損傷［2］;亦具有抗神經元凋亡的作用［3，4］。有趣的是，當小鼠吸入H2S后能降低體內代謝約90%，然后進入“假死”狀態［5］，由此而保護小鼠對抗隨后致命的缺氧損傷［6］。但是H2S能否保護神經細胞對抗化學性缺氧引起的損傷尚未明確。

熱休克蛋白(heat shock proteins，Hsp)是細胞受到各種理化因素刺激(包括缺氧)后誘導機體產生的一組保護性蛋白，包括Hsp90、Hsp70和Hsp40等。這些蛋白廣泛存在于生物界的原核及真核生物細胞中，參與調節其多種靶蛋白(包括存活和凋亡因子)的折疊和結構穩定［7］。在缺氧條件下，Hsp90的表達上調可對抗心肌缺血/再灌注引起的損傷［8］。應用Hsp90抑制劑抑制其表達可增加心肌的缺血/再灌注損傷［9］，然而，H2S抗化學性缺氧的神經細胞保護作用是否與Hsp90信號通路有關，Hsp90在其中起何作用還不清楚。由此，本研究應用CoCl2(一種化學性低氧模擬劑)損傷具有神經元形態和功能特征的來源于大鼠嗜鉻細胞瘤的PC12細胞，以建立化學性缺氧誘導的神經細胞損傷模型，擬探討H2S能否對抗CoCl2引起的PC12細胞損傷及Hsp90在其中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料 NaHS、氯化鈷、17-丙烯胺基-17-去甲氧基格爾德霉素(17-allylamino-17-demethoxygeldanamycin，17-AAG)、Hoechst 33258 購自美國 Sigma Aldrich公司，CCK-8試劑盒購自日本Dojindo Lab，DMEM培養基購自Gibco公司。PC12細胞由中山大學實驗動物中心提供。

1.2 細胞培養 PC12細胞培養于含10%胎牛血清的DMEM培養基中。于37℃、5%CO2條件下培養，選取對數生長期細胞進行實驗。

1.3 實驗分組 實驗分為6組:① 空白對照組(Control);② NaHS預處理組(PC):單獨應用400 μmol·L－1NaHS處理PC12細胞3 h;③ CoCl2損傷組(CoCl2):應用600 μmol·L－1CoCl2處理 PC12 細胞48 h;④ PC+CoCl2;⑤ 17-AAG+PC+CoCl2:在應用 NaHS 前30 min，用2 μmol·L－1Hsp90 抑制劑17-AAG處理細胞30 min，其余的實驗步驟與④ 組相同;⑥ 單獨17-AAG 組(17-AAG):應用2 μmol·L－117-AAG處理PC12細胞30 min。

1.4 細胞存活率的檢測 取對數生長期細胞，以1×104/孔接種于96孔板，在37℃、5%CO2條件下培養過夜后，更換為含有不同處理因素的培養基，每組設5個復孔。處理結束后各組細胞分別與CCK-8(每孔 100 μl加 10 μl CCK-8)37℃孵育 4 h，隨后在酶聯免疫檢測儀測定每孔的吸收值(λ=450 nm)，按公式:存活率(%)=實驗組OD/正常對照組OD×100%，求出實驗組的存活率，重復3次。

1.5 Hoechst 33258核染色法檢測細胞凋亡 把PC12細胞接種于24孔板內，按實驗分組要求給不同的處理因素作用一定時間后，PBS洗兩次，加入新鮮配制的4%多聚甲醛，4℃固定10 min，PBS漂洗后，加入5 mg·L－1Hoechst 33258試劑，室溫輕搖10 min。在熒光顯微鏡(TE-2000，Nikon，Japan)下攝片，正常細胞核表現為彌漫均勻的低強度熒光，凋亡細胞核呈濃染致密固縮狀態或顆粒狀熒光。隨機選取視野在熒光顯微鏡下攝片。

1.6 PI染色流式細胞儀(FCM)檢測細胞凋亡細胞按實驗要求給以不同的因素處理后，離心收集細胞，PBS洗兩次，加入預冷的70%乙醇4℃固定過夜。用PBS洗兩遍，PI染色后，用流式細胞儀檢測細胞內DNA的含量(激發波長:488 nm;發射波長:610 nm)。每樣本計數12 000個細胞，以DNA組方圖中低于G1期DNA含量的亞G1峰的大小代表凋亡細胞數的多少。

1.7 Western blot法檢測Hsp90的表達 細胞按實驗分組給以不同的處理因素，離心收集。預冷的PBS洗滌兩次，加入裂解緩沖液，4℃靜置30 min。12 000×g離心10 min，取上清，采用BCA法進行蛋白定量。總蛋白經SDS-PAGE分離后，轉移至PVDF膜上。用5%脫脂奶粉封閉1.5 h。隨后加入Hsp90抗體(1∶1 000)，4℃孵育過夜，TBST洗3次，加入相應的二抗，孵育1 h，漂洗3次。將PVDF膜用發光試劑ECL顯色后，用Image J 1.41o進行灰度分析，每樣本重復3次。

1.8 統計學處理 實驗數據經SPSS 11.0統計軟件進行統計分析，數據用ˉ±s表示，統計方法采用單因素方差分析。

2 結果

2.1 H2S減弱CoCl2誘導的細胞毒性作用 本文在預實驗時證實600 μmol·L－1CoCl2能明顯地損傷 PC12 細胞，因此，本研究中應用 600 μmol·L－1CoCl2作為CoCl2的有效損傷濃度。Fig 1顯示，600 μmol·L－1CoCl2作用 PC12 細胞 24 h，對細胞具有明顯的細胞毒性作用，使細胞存活率降低至(54.13±4.49)%，與對照組比較，差異具有統計學意義(P<0.01)。400 μmol·L－1NaHS 預處理 3 h 能對抗CoCl2的細胞毒性作用，使細胞存活率從(54.13±4.49)%提高至(79.42±3.29)%(P<0.01)。

Fig 1 Effects of different treatments on viability of PC12 cells(n=5)

2.2 H2S抑制CoCl2誘導的細胞凋亡作用 Fig 2的Hoechst 33258染色熒光顯微鏡照相術檢測的結果顯示，正常的PC12細胞呈現為散在的低強度熒光(Fig 2A)。凋亡細胞核則呈濃染致密的固縮狀態或顆粒狀熒光。600 μmol·L－1CoCl2作用 PC12細胞48 h，使凋亡細胞的數目明顯增多(Fig 2C)。400 μmol·L－1NaHS本身不引起細胞凋亡(Fig 2B)，但能保護PC12細胞對抗CoCl2的致凋亡作用，使凋亡細胞數量減少(Fig 2D)。與上述實驗結果相似，流式細胞檢測的結果(Fig 3)顯示，正常時，PC12細胞的凋亡數量很低，CoCl2卻使細胞凋亡率增加至(38.8 ±1.27)%;400 μmol·L－1NaHS 預處理能使CoCl2誘導的細胞凋亡率降低至(15.1±0.47)%(P<0.01)。

Fig 2 Morphological changes in apoptotic cells of differentgroups assessed by Hoechst 33258 staining

2.3 H2S預處理上調Hsp90的表達 給予PC12細胞 NaHS 預處理，觀察預處理后1、3、6、9、12 及 24 h Hsp90的表達情況。Western blot的檢測結果顯示，400 μmol·L－1NaHS預處理1 h ，可使 PC12 細胞Hsp90表達開始升高;在預處理3 h，Hsp90表達達到高峰，與對照組比較，差異有統計學意義(P<0.01，Fig 4);隨后，Hsp90的表達水平下降，作用24 h后，Hsp90表達恢復到對照水平，提示H2S預處理對Hsp90表達具有促進作用。

Fig 3 Effects of different treatments on apoptosis of PC12 cells(n=3)

Fig 4 Effects of H2S preconditioning onexpression of Hsp90 in different time(n=3)

值得注意的是 Fig 5顯示，CoCl2(600 μmol·L－1)也能上調Hsp90的表達，而且，H2S預處理能進一步增強CoCl2對PC12細胞Hsp90表達的上調作用，提示 H2S的細胞保護作用可能與其上調Hsp90有關。

Fig 5 17-AAG on Hsp90 expression(n=3)

2.4 Hsp90介導H2S抗CoCl2誘導的細胞損傷作用 為了探討Hsp90在H2S誘導的細胞保護中的作用，本文在NaHS預處理前30 min使用Hsp90抑制劑17-AAG(2 μmol·L－1)，觀察對 Hsp90 表達及NaHS預處理誘導的細胞保護作用的影響。

Fig 5的Western blot結果顯示，17-AAG可明顯抑制H2S誘導的Hsp90表達增高。同時，17-AAG可明顯拮抗H2S的細胞保護作用:在NaHS預處理前30 min加入2 μmol·L－117-AAG 后可使細胞存活率下降到(55.74±6.47)%(與H2S保護組相比，P<0.01，Fig 1);使細胞凋亡率再次回升到(34.5±0.48)%(與 H2S保護組相比，P<0.01，Fig 3);Hoechst 33258核染色形態學結果亦顯示，17-AAG增加了細胞凋亡，減弱了H2S的細胞保護作用(Fig 2)。

上述結果提示Hsp90介導了H2S抗CoCl2誘導的細胞損傷作用。

3 討論

最近，本實驗室證實，H2S預處理能對抗化學性缺氧引起的心肌損傷［10］。本文再次證實，H2S預處理能保護具有神經元的形態和功能特征的PC12細胞對抗CoCl2引起的損傷作用。表明在不同的細胞模型，在體實驗或離體實驗，H2S均具有抗缺氧/缺血的細胞保護作用，這與曾因明課題組近期的研究結果相一致［11，12］。

新近研究表明，H2S能抑制缺血/再灌注引起的肝損傷，并增加Hsp90和抗凋亡蛋白Bcl-2的表達，提示H2S可通過上調Hsp90表達來保護肝細胞對抗缺血/再灌注損傷［13］。Hsp90是一種重要的細胞保護蛋白，可對抗包括缺氧/缺血等各種致死性的因素引起的細胞損傷［14］。研究表明，在心肌缺血區Hsp90高表達可保護心肌免受缺血/再灌注損傷;同時，過表達Hsp90也可抗心肌缺氧損傷［15］。

然而，Hsp90是否介導H2S抗化學性缺氧損傷的神經保護作用，至今未見報道。為了揭示兩者的關系，本實驗觀察了400 μmol·L－1H2S供體NaHS作用PC12細胞不同時間對Hsp90表達的影響。本文發現，H2S預處理對PC12細胞Hsp90表達有明顯的上調作用。表明H2S是一種有效激活保護性蛋白Hsp90的物質，這與 Jha等［13］的研究結果相一致。

為了進一步揭示Hsp90在H2S保護PC12細胞抗化學性缺氧損傷中的作用，本研究在NaHS預處理前30 min使用Hsp90抑制劑17-AAG。實驗結果表明，Hsp90抑制劑17-AAG在抑制Hsp90表達的同時，能明顯地阻斷H2S的細胞保護作用，使PC12細胞存活率降低及凋亡率增加，提示Hsp90介導H2S誘導的神經保護作用，本實驗為深入闡明H2S的神經細胞保護作用機制提供了新穎的實驗依據。

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