幾丁糖和聚乳酸防粘連凝膠及玻璃酸鈉預防硬膜外瘢痕粘連的實驗研究

武宜亮 新疆醫科大學30期研究生 烏魯木齊830000

李建江 黃異飛 吳彥生 楊 濤 張 斌 新疆醫科大學附屬中醫醫院脊柱二科

椎板切除是腰椎后路手術常見的減壓方式及手術入路途徑，術后必然會形成硬脊膜瘢痕粘連，過量的硬膜外瘢痕粘連的形成可引起硬膜和神經根的壓迫及牽拉，嚴重時可導致椎板切除后的腰腿痛等癥狀復發，影響手術效果。而其所產生的典型臨床癥狀，是下腰痛伴有或不伴有下肢放射痛，被稱為下腰椎手術失敗綜合征(FBSS)。目前，臨床上常應用玻璃酸鈉以預防硬膜外粘連的發生。幾丁糖及聚乳酸防粘連凝膠也具有類似功效被運用于臨床，但其應用于椎板切除術后防止硬膜外粘連還缺乏較科學的實驗支持，或其療效尚缺少十分確鑿的證據。本實驗旨在通過對預防椎板切除后硬膜外瘢痕粘連的作用效果觀察及相關機制的探討，為臨床應用幾丁糖與聚乳酸防粘凝膠提供理論和實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材 料 幾丁糖(上海其勝藥物有限公司生產)，聚乳酸防粘連凝膠(石家莊市瑞諾生物醫學材料有限公司生產)，玻璃酸鈉(山東正大福瑞達制藥有限公司生產)。

1.2 動物分組 清潔級成年雄性SD大鼠72只，體重250g±10g。根據完全隨機化設計原則按隨機數字表法隨機分幾丁糖組、聚乳酸防粘連凝膠組、玻璃酸鈉組和生理鹽水對照組，每組18只。每組再按隨機數字表法隨機分為術后4、8、12周3個時間點組，每組6只。

1.3 手術方法 10%水合氯醛腹腔注射麻醉后，取腰背部正中切口，長約3cm，切開皮膚、皮下組織，向兩側剝離骶棘肌，暴露L1-2椎板，咬除L1-2全椎板，造成0.4cm×1.0cm大小的椎板缺損，切除部分黃韌帶，保留完整硬膜，紗布輕拭干凈并于硬膜外及兩側神經根表面涂布相應藥物(聚乳酸待成膜)后逐層縫合肌肉及皮膚，適宜溫度下促進大鼠麻醉清醒，而后回籠常規飼養。

1.4 觀察項目

1.4.1 大體觀察 四組分別于術后4、8、12周各取6只大鼠處死，對術段脊柱上三分之一標本按照Lawson標準［1］行粘連程度評分。0度:硬膜與瘢痕組織無明顯粘連;Ⅰ度:硬膜與瘢痕組織有散在粘連，但易于分離;Ⅱ度:硬膜與瘢痕廣泛粘連，但可鈍性分離而不損傷硬膜;Ⅲ度:硬膜與瘢痕組織粘連致密，需銳性分離。

1.4.2 組織學觀察 四組分別于術后4、8、12周大體觀察同時，將術段脊柱連同骶棘肌整塊取出并作精細修整，并將其以10%甲醛溶液固定24小時，而后用微型薄鋸垂直于脊柱縱軸取未經肉眼觀察的中三分之一標本放入10%甲醛溶液中再次固定，3天后取出予以10%鹽酸脫鈣1周，而后石蠟包埋，取3μm超薄切片HE染色后光鏡觀察，按改良Nussbaum標準［2］行組織學評分:0.5分:硬膜外瘢痕粘連面積＜25%，或硬膜外膠原纖維稀疏，或瘢痕無明顯側后方延伸;1分:硬膜外瘢痕粘連面積＜50%，或硬膜外膠原較致密，或瘢痕向側方延伸至神經根和椎板間隙之間或部分嵌入椎板間隙，但未壓迫硬膜囊;1.5分:硬膜外瘢痕粘連面積≥50%，或膠原致密，或瘢痕包繞，延伸到一側或雙側神經根，嵌入椎板間隙，硬膜囊或脊髓受壓。每項1.5分，合計4.5分，并以此分級:Ⅰ級:0.5≤評分≤1.5;Ⅱ級:2.0≤評分≤3.0;Ⅲ級:3.5≤評分≤4.5。

1.4.3 透射電鏡觀察 術后12周在取光鏡標本時于四組各取3只大鼠L1-2標本的硬膜外瘢痕組織，經戊二醛、四氧化鋨固定，丙酮脫水，EPON812包埋，醋酸鈾及枸椽酸鉛雙重染色，H-600型透射電鏡觀察纖維細胞的內部結構(高爾基體、核糖體、線粒體及內質網等)，重點觀察病變處靠近硬膜外纖維細胞。

2 結果

2.1 硬膜外瘢痕組織粘連大體觀察

2.1.1 術后4周 術后4周聚乳酸防粘連凝膠組見中等量瘢痕組織充填椎板缺損區，硬膜囊光滑，瘢痕與硬膜無粘連。幾丁糖組見中等量瘢痕組織充填椎板缺損區，質地較致密，大部分標本未見椎板缺損處瘢痕組織與硬膜囊粘連，少數標本有散在粘連并易于鈍性分離。玻璃酸鈉組見中等量瘢痕組織充填椎板缺損區，硬膜囊光滑，瘢痕與硬膜無粘連。三組評分與生理鹽水組比較，差異有統計學意義(P＜0.01);玻璃酸鈉組、幾丁糖及聚乳酸防粘連凝膠組間比較，差異無統計學意義(P＞0.05)，見表1。

表1 四組術后4周硬膜外瘢痕粘連大體觀察 只

2.1.2 術后8周 術后8周聚乳酸防粘連凝膠組見瘢痕組織覆蓋椎板缺損區，質地硬，大部分標本硬膜囊光滑，少數標本瘢痕與硬膜囊存在散在粘連，但易于鈍性分離。幾丁糖組見瘢痕組織覆蓋椎板缺損區，質地硬，與硬膜粘連較致密，但可鈍性分離。玻璃酸鈉組見瘢痕組織覆蓋椎板缺損區，質地較硬，與硬膜粘連致密，少數標本可鈍性分離。四組評分比較，差異有統計學意義(P＜0.01)，聚乳酸防粘連凝膠組優于幾丁糖組、玻璃酸鈉組及生理鹽水組(P＜0.01)，幾丁糖組、玻璃酸鈉組優于生理鹽水組(P＜0.01)，幾丁糖組優于玻璃酸鈉組(P＜0.01)。見表2。

表2 四組術后8周硬膜外瘢痕粘連大體觀察 只

2.1.3 術后12周 術后12周聚乳酸防粘連凝膠組見瘢痕組織覆蓋椎板缺損區，質地硬，大部分標本硬膜囊光滑，硬膜外瘢痕組織與硬膜無粘連。幾丁糖組見瘢痕組織覆蓋椎板缺損區，質地較硬，與硬膜粘連較致密，但仍可鈍性分離。玻璃酸鈉組見瘢痕組織覆蓋椎板缺損區，質地較硬，瘢痕組織與硬膜粘連致密，不可鈍性分離。四組評分比較，差異有統計學意義(P＜0.01)，聚乳酸防粘連凝膠組優于幾丁糖組、玻璃酸鈉組及生理鹽水組(P＜0.01)，幾丁糖組、玻璃酸鈉組優于生理鹽水組(P＜0.01)，幾丁糖組優于玻璃酸鈉組(P＜0.01)。見表3。

表3 四組術后12周硬膜外瘢痕粘連大體觀察 只

2.2 硬膜外瘢痕粘連組織學觀察

2.2.1 術后4周 術后4周光鏡下(下同)聚乳酸防粘連凝膠組見硬膜外膠原纖維增生較多，膠原纖維較疏松，排列規則;瘢痕粘連面積小，瘢痕組織與硬膜間見明顯間隙，瘢痕粘連未向側后方延伸，硬膜囊及脊髓未見受壓。幾丁糖組見硬膜外膠原纖維增生較多，膠原纖維疏松;瘢痕粘連面積小，瘢痕粘連有輕度側后方延伸，硬膜囊及脊髓未見受壓。玻璃酸鈉組見硬膜外膠原纖維增生多，膠原纖維較致密;瘢痕粘連面積小，瘢痕粘連未見向側后方延伸，硬膜囊及脊髓未見明顯受壓。三組評分與生理鹽水組比較，差異有統計學意義(P＜0.01);玻璃酸鈉組、幾丁糖組、及聚乳酸防粘連凝膠組間比較，差異無統計學意義(P＞0.05)。見表4。

表4 四組術后4周硬膜外瘢痕粘連組織學觀察 只

2.2.2 術后8周 術后8周聚乳酸防粘連凝膠組見硬膜外膠原組織少量增生，膠原纖維密度較低，排列規則;硬膜外瘢痕粘連面積小，瘢痕粘連未向側后方延伸，硬膜囊未見受壓同時存在明顯腔隙。幾丁糖組見硬膜外膠原組織中等量增生，膠原密度較高，排列較規則，瘢痕粘連面積較小，硬膜外腔有較明顯間隙，部分標本局部硬膜囊輕度受壓。玻璃酸鈉組見硬膜外膠原組織大量增生，膠原密度高，排列雜亂，瘢痕粘連面積較大，硬膜外腔有部分間隙并有散在性粘連，局部硬膜囊中度受壓。四組評分比較，差異有統計學意義(P＜0.01)，聚乳酸防粘連凝膠組優于幾丁糖組、玻璃酸鈉組及生理鹽水組(P＜0.01)，幾丁糖組、玻璃酸鈉組優于生理鹽水組(P＜0.01)，幾丁糖組優于玻璃酸鈉組(P＜0.01)。見表5。

表5 四組術后8周硬膜外瘢痕粘連組織學觀察 只

2.2.3 術后12周 術后12周聚乳酸防粘連凝酸組見硬膜外有少量膠原組織，膠原纖維密度低，排列規則;硬膜外瘢痕組織與硬脊膜幾乎無粘連，瘢痕粘連亦未向側后方延伸，硬膜囊未見受壓并存在明顯腔隙。幾丁糖組見硬膜外有中等量膠原組織，膠原密度較高，排列較規則，部分標本硬膜外瘢痕組織與硬脊膜有粘連但面積較小，硬膜外腔間隙較聚乳酸防粘連凝膠組差，同時見部分標本局部硬膜囊輕度受壓。玻璃酸鈉組見硬膜外有大量膠原組織，膠原密度較高，排列不規則，小部分標本硬膜外瘢痕組織與硬脊膜有較明顯間隙。四組評分比較，差異有統計學意義(P＜0.01)，聚乳酸防粘連凝膠組優于幾丁糖組、玻璃酸鈉組及生理鹽水組(P＜0.01)，幾丁糖組、玻璃酸鈉組優于生理鹽水組(P＜0.01)，幾丁糖組優于玻璃酸鈉組(P＜0.01)。見表6，圖1 ～4。

表6 四組術后12周硬膜外瘢痕粘連組織學觀察 只

圖1 幾丁糖組(12周)

圖2 聚乳酸防粘連凝膠組(12周)

圖3 玻璃酸鈉組(12周)

圖4 生理鹽水組(12周)

2.3 透射電鏡觀察 術后12周電鏡下，生理鹽水組纖維細胞中細胞器充分，合成膠原功能完全;玻璃酸鈉組細胞器較少，胞質較少，線粒體較少，合成膠原功能較低，細胞核染色較深;幾丁糖組細胞器較玻璃酸鈉組少，胞質較多，合成膠原功能較低;聚乳酸防粘連凝膠組細胞器最少，胞質欠豐富，合成膠原功能最低，細胞呈現多角形形狀同時膠原纖維成束，相對靜止。

3 討論

3.1 椎板切除后硬膜外瘢痕粘連形成機制 瘢痕組織是椎板切除后組織缺損區修復的必然產物。瘢痕修復分為三個階段［3］:第一階段為局部炎癥反應階段，在創傷后立即發生，持續約3～5天。主要表現為傷口出血停止，組織缺損區為血凝塊所充填，繼而引起各種趨化因子的釋放，引起局部巨噬細胞、成纖維細胞、血管內皮細胞、肥大細胞、粒細胞及各種淋巴細胞的聚集。第二階段為細胞增殖分化和肉芽組織形成階段，持續約2～4周。成纖維細胞產生膠原纖維，血管內皮細胞和巨噬細胞大量增殖，創口局部血液和滲出液中的纖維蛋白原凝固成塊，成纖維細胞及血管內皮細胞向血腫內侵入，毛細血管生長增殖而形成肉芽組織。第三階段，組織重建階段，成纖維細胞逐漸減少，轉化為纖維細胞，毛細血管網消退，間質中的液體成分減少，肉芽組織轉變為致密的瘢痕組織，此過程持續數周至幾年。

3.2 椎板切除后硬膜外瘢痕粘連防治方法 硬膜外粘連的預防目前主要有三種［4～7］:①采用顯微外科技術;②采用藥物控制炎性反應;③采用隔離物阻隔。本實驗采用隔離物避免瘢痕與硬膜接觸來預防硬膜外瘢痕的形成。玻璃酸鈉是廣泛存在于人及動物各種組織的高分子物質，具有非常好的生物相容性，但因保持凝膠狀態難以在特定的區域長期停留，從而影響其效果［8］。在本實驗過程中涂布此藥物于硬膜外后，因縫合肌肉組織及筋膜層時容易從切口溢出，因此影響其效果。同時因玻璃酸鈉吸收速度較快故使其較早失去了物理屏障阻隔瘢痕長入的作用，故抗粘連效果欠佳。幾丁糖是由甲殼類動物外殼中提取的天然高分子化合物，大量的基礎研究證實其無毒、無刺激性、無抗原反應，具有可靠的生物相容性，是一種在體內可降解吸收的新型醫用生物材料，并具有獨特地選擇性抑制成纖維細胞和抑制細菌生長從而達到預防粘連的目的。但在本實驗過程中因其流動性較強，故不能穩定地停留在術后手術區域，并可隨著體位地改變而發生向低處流動，故其預防硬膜外粘連并不十分理想。聚乳酸防粘連凝膠是以合成高分子材料聚乳酸為主要原料生產的，遇到水或組織液后迅速凝固成固態膜的新型醫用防粘連材料，此膜具有以下特點:①微孔狀結構保證了膜具有良好的柔軟性;②與硬膜囊及神經根表面形狀完全吻合，貼附性好，不隨體位變化移動同時不被引流管引流出;③具有良好的透氣性，不會妨礙硬膜外組織愈合;④成膜厚度在0.07～0.13mm之間，可避免藥物經手術切口溢出。故聚乳酸防粘連凝膠預防硬膜外粘連的作用與以下幾方面有關:①可作為一種良好的止血劑。聚乳酸防粘連凝膠遇到組織液即發生凝固，在硬膜囊及神經根表面形成一層固態膜封閉出血點故可減少術后血腫的形成進而從源頭上減少瘢痕組織的形成［9］。在本實驗造模時運用聚乳酸防粘連凝膠能夠很好的封閉細微的出血點極大程度上減少了硬膜外瘢痕的形成。②具有良好的機械隔離作用:聚乳酸防粘連凝膠為一種半流體物質，當接觸組織后即凝固成包繞硬脊膜及神經根的固態物質，從而達到三維立體預防粘連的要求，起到良好的機械隔離作用。本實驗中，玻璃酸鈉及幾丁糖由于為凝膠狀物質同時在其接觸硬膜及組織液后其性狀不發生改變，故隔離效果較聚乳酸防粘連凝膠差。③聚乳酸防粘連凝膠較長的降解時間可以渡過瘢痕增生活躍期。在本實驗第8及12周取材過程中可觀察到玻璃酸鈉及幾丁糖已大部分或完全吸收，而聚乳酸防粘連凝膠由于其膜性結構及較長的降解時間故可見完整的薄膜帖敷于硬膜上，同時在硬膜與瘢痕之間可見一明顯腔隙，從而增強了其效果。④有抑制成纖維細胞生長的作用。通過電鏡觀察，本實驗第12周取材后幾丁糖組硬膜外組織中細胞器較少同時合成膠原功能較低，聚乳酸組中細胞器最少，合成膠原功能最低，并見細胞呈現多角形形狀。故幾丁糖、聚乳酸防粘連凝膠及玻璃酸鈉都有預防硬膜外粘連形成的作用，但以聚乳酸防粘連凝膠為優。

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