辛伐他汀對慢性心力衰竭兔心肌PPARγ mRNA、蛋白表達及核因子κB表達、活性的影響

齊洪濤，劉志華，蔣 彬，鄒 操，趙彩明，李紅霞，韓蓮花，蔣庭波，宋建平，蔣文平

(1.蘇州大學附屬第一醫院心內科，江蘇蘇州 215006;2.青島大學第二附屬醫院心功能科，山東青島 266042)

過氧化物酶體增殖物激活受體(peroxisome proliferators activated receptor，PPAR)是核甾體激素受體，能被脂肪酸以及外源性過氧化體增殖物激活劑激活，調控參與脂類代謝的某些酶的基因表達［1］，同時PPARs的激活對一些細胞的生長、分化、凋亡有重要影響［2］。最近的研究顯示PPARγ對心肌肥厚具有抑制作用，PPARγ激活能改善左室重構和恢復心功能，抑制心肌細胞肥大和纖維化。PPARγ滅活，導致心肌肥厚。PPARγ對心室重構的影響，主要與降低核因子 κB(nuclear factor kappa B，NF-κB)的活性有關。NF-κB是一種具有基因轉錄多向調控作用的核轉錄因子，在心肌肥厚、心肌細胞凋亡、心力衰竭的發生中，NF-κB發揮重要作用，NF-κB的過分表達導致心肌細胞肥大。近期研究證明，PPARγ對NF-κB有負向調節關系［3］，他汀類藥物對PPARγ有激活作用，并通過激活PPARγ抑制NF-κB活性，抑制心肌肥厚［4，5］。本研究觀察了辛伐他汀對PPARγ mRNA及蛋白表達的影響，及辛伐他汀對NF-κB亞基p65蛋白表達及活性的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 24只新西蘭白兔均來自蘇州大學實驗動物中心，♀♂不拘，體重1.8～2.8 kg，分為4組，每組6只，1組:假手術組;2組:心衰對照組，術后觀察8 wk。3組:早干預組，手術后給予辛伐他汀(Merck Sharp＆Dohme Ltd產品，杭州默沙東公司分裝)5 mg·kg-1·d-1，采用灌胃方法給藥，連續服8 wk。4組:晚干預組，術后4 wk給予辛伐他汀5 mg·kg-1·d-1，灌胃方法給藥，連續4 wk。

1.2 心臟前后負荷增加模型制作 通過破壞主動脈瓣造成主動脈瓣返流，2 wk后實施腹主動脈縮窄術，制作前、后符合增加心力衰竭模型［6］。心臟超聲檢查:于主動脈瓣破壞后及觀察結束時，做心臟超聲檢查，用12 Hz專用探頭，做M超及彩色多普勒超聲，觀察左心室內徑及室壁厚度、左室射血分數(EF)、左室長軸縮短率(FS)，破瓣后主動脈瓣返流情況。實驗觀察終止時，再次手術，分離另一側頸總動脈，測量左室舒張末壓。取出心臟稱全心及左室重量，計算心臟重量/體重、左室重量/體重。左心室組織放液氮中儲存。

1.3 測定蛋白濃度 用德國Merck KgaA ProteoExtract?Subcellular proteome Extraction Kit提取心肌組織細胞核蛋白。Bradford蛋白濃度測定試劑盒(上海西唐生物科技有限公司)測定蛋白濃度。

1.4 Western blot檢測細胞核PPARγ、p65蛋白表達 PPARγ、p65蛋白分子量均為65 ku，配制10%分離膠。膠凝固后，配制5%的濃縮膠。分別取80 μg細胞膜蛋白加5×上樣緩沖液2 μl，沸水變性5 min。將樣品蛋白及預染蛋白Marker加入上樣孔，電泳、轉膜。免疫反應:用封閉液稀釋一抗到要求濃度，抗 PPARγ(5 mg·L-1)，抗 p65(10 mg·L-1)，抗β-actin(1∶500)。將膜放入一抗稀釋液中，4℃孵育過夜。將膜放入二抗稀釋液，室溫下在搖床上孵育1 h。化學發光，顯影，定影。圖像分析用掃描儀將X光片圖像掃至電腦，用UVIDoc軟件進行條帶灰度分析，計算每標本PPARγ、p65與β-actin灰度比。

1.5 RT-PCR檢測心肌組織PPARγ mRNA表達每一標本取100 mg心肌組織，用TRIzol提取mRNA，室溫干燥，測A260/A280值。用美國Fermentas逆轉錄試劑盒做逆轉錄。擴增:將PCR管置于冰上，建立下列反應體系:10 × buffer 2.5 μl，MgCl22 μl，Tag 酶 0.25 μl，dNTP 0.5 μl，10 mmol·L-1引物(S)0.625 μl，10 mmol·L-1(A)0.625 μl，模板 2 μl，加DEPC 水至25 μl。引物:PPARγ 上游:5′-TTCCTGTCAAGATCGCCCTCG-3′;下 游:5′-TGGGGATGTCTCATAATGCCA-3′。β-actin 上游:5′-GTGCTGTCCCTGTACGCCTCTGG-3′;下游:5′-CTTCTCCTTGATGTCCCGCACGAT-3′。擴增條件為94℃預變性4 min，然后，94℃變性 1 min，55℃退火1 min，72℃延長1 min 20 s，35個循環，72℃延伸10 min。電泳及圖像分析:用Bio Rad凝膠成像系統quantity one軟件分析條帶灰度，計算每一樣本PPARγ mRNA灰度與βactin mRNA灰度比。

1.6 電泳遷移率變動試驗(EMSA)檢測心肌細胞核p65活性 用Subcellular proteome Extraction Kit(Merck KgaA ProteoExtract?，German)提取細胞核蛋白。用含NF-κB核苷酸同序列(5′-AGTTGAGGGGACTTTCCCAGGC-3′)結合位點的寡核苷酸完成電泳遷移率變動試驗。在下列反應中完成寡核苷酸標記:2 μl寡核苷酸(1.75 pmol/Al)，2 μl T4 多核苷酸激酶緩沖液，1 μl T4多核苷酸激酶(10 U/Al)，2.5 μl［γ-32P］ATP(185 TBq/mmol at 370 MBq/ml)，37℃孵育1 h。加入90 μl TE 緩沖液(10 mmol·L-1Tris-HCl pH 7.4 and 1 mmol·L-1EDTA)。10 μg核蛋白在冰上加入緩沖液(10 mmol·L-1Tris-HCl pH 8.0，25 mmol·L-1KCl，0.5 mmol·L-1DTT，0.1 mmol·L-1EDTA pH 8.0，5%glycerol，5 g·L-1BSA，100 mg·L-1tRNA and 50 mg·L-1poly(dI-dC))，反應 10 min，然后加入 15 μl標記探針(約60.000 cpm)，4℃孵育15 min。同時完成特異性競爭試驗。在標記探針加入前先加入未標記同序列競爭核苷酸。在標記探針4℃孵育前加入p65抗體，然后將蛋白-DNA復合物4℃ 5%的聚丙酰胺電泳，將膠放在濾紙上，干燥后，用磷屏壓膠1 h，用磷屏掃描儀檢測32P放射量，掃描磷屏，用ImageQuant軟件分析各標本圖像中32P放射量。

2 結果

2.1 4組心臟、左心室重量及心臟/體重、左心室/體重比較 心力衰竭對照組心臟重量、左心室重量、心臟重量指數、左心室重量指數均大于假手術組，早干預組上述指標均低于心力衰竭對照組，晚干預組心臟重量、左心室重量、心臟重量指數低于心力衰竭對照組，見Tab 1。

2.2 4組觀察開始及結束時左室最大舒張壓比較實驗開始時，各組左室舒張末壓(LVEP)無差異。實驗終止時，心衰對照組高于假手術組，早、晚干預組LVEP均低于心衰對照組，見Tab 2。

Tab 2 Change after heart failure and effect of simvastatin on LVEDP±s，n=6)

Tab 2 Change after heart failure and effect of simvastatin on LVEDP±s，n=6)

**P＜0.01 vs groupⅡ;ΔΔP＜0.01 vs groupⅠ

GroupⅠ GroupⅡ GroupⅢ GroupⅣbegin of experiment -2.50±1.41 -3.00±1.65 -2.00±0.63 -2.50±1.52 end of experiment -0.50±1.34** 14.00±2.67ΔΔ 0.33±1.97**2.33±1.89**

2.3 4組心肌組織PPARγ mRNA表達比較 與假手術組比較，心力衰竭組PPARγ mRNA表達降低，辛伐他汀干預后，PPARγ mRNA表達明顯增加，且早干預組表達增加比晚干預組更加明顯，見Tab 3及Fig 1。

Tab 3 Change after heart failure and effect of simvastatin on cardiomyocyte nuclear PPARγ mRNA expression(±s，n=6)

Tab 3 Change after heart failure and effect of simvastatin on cardiomyocyte nuclear PPARγ mRNA expression(±s，n=6)

**P＜0.01 vs groupⅠ;△△P＜0.01 vs groupⅡ;#P＜0.05 vs groupⅣ

GroupⅠ GroupⅡ GroupⅢ GroupⅣPPARγ mRNA 0.720±0.018 0.308±0.010**0.522±0.009△△#0.448±0.024△△

2.4 4組心肌組織細胞核PPARγ蛋白表達的比較

心衰組PPARγ表達低于健康對照組，經辛伐他汀治療后，早干預組及晚干預組PPARγ蛋白表達增加(P＜0.01，P＜0.01)。早干預組PPARγ蛋白表達比晚干預組增加明顯，但差異無統計學意義，見Tab 4，Fig 2。

Fig 1 RT-PCR of cardiomyocyte nuclear PPARγ mRNA expression in four groups(n=6)

Tab 4 Change after heart failure and effect of simvastatin on cardiomyocyte nuclear PPARγ protein expression(±s，n=6)

Tab 4 Change after heart failure and effect of simvastatin on cardiomyocyte nuclear PPARγ protein expression(±s，n=6)

**P＜0.01 vs groupⅠ;△△P＜0.01 vs groupⅡ

GroupⅠ GroupⅡ GroupⅢ GroupⅣPPARγ protein 0.819±0.038 0.403±0.016**0.638±0.017△△0.587±0.021△△

Fig 2 Western Blot of cardiomyocyte nuclear PPARγ protein expression in four groups(n=6)

2.5 4組心肌組織細胞核NF-κB亞基p65蛋白表達的比較 心力衰竭組心肌細胞和中p65表達明顯增加，辛伐他汀干預后p65表達降低，早干預組表達比晚干預組降低更明顯，但未達到統計學意義，見Tab 5，Fig 3。

Tab 5 Change after heart failure and effect of simvastatin on cardiomyocyte nuclear p65 protein expression( ± s，n=6)

Tab 5 Change after heart failure and effect of simvastatin on cardiomyocyte nuclear p65 protein expression( ± s，n=6)

**P＜0.01 vs groupⅠ;△△P＜0.01 vs groupⅡ

GroupⅠ GroupⅡ GroupⅢ GroupⅣp65 0.417±0.013 0.715±0.038**0.491±0.015△△0.537±0.032△△

Tab 1Changes after heart failure and effects of simvastatin on HW，LVW，HW/BW radio and LVW/BW(±s，n=6)

Tab 1Changes after heart failure and effects of simvastatin on HW，LVW，HW/BW radio and LVW/BW(±s，n=6)

*P＜0.05，**P ＜0.01 vs groupⅡ;ΔΔP＜0.01 vs groupⅠ

GroupⅠ GroupⅡ GroupⅢ GroupⅣHeart weight/g 4.95±0.42** 11.02±0.53ΔΔ 6.07±0.55** 8.45±0.41*LV weight/g 3.52±0.35** 7.67±0.34ΔΔ 4.19±0.38** 6.29±0.36**HW/BW radio/g·kg-1 2.40±0.23** 4.45±0.35ΔΔ 2.73±0.27** 3.32±0.17*LVW/BW/g·kg-1 1.70±0.20** 3.12±0.28ΔΔ 1.87±0.13**2.47±0.15

Fig 3 Western Blot of cardiomyocyte nuclear p65 protein expression in four groups(n=6)The p65 protein expression of cardiomyocyte nuclear was increased in failure heart(groupⅡ)，simvastatin inhibited the p65 protein expression of cardiomyocyte nuclear(groupⅢ，groupⅣ)

2.6 4組心肌組織細胞核NF-κB亞基p65活性比較 心力衰竭組心肌細胞核p65活性明顯增強，給予辛伐他汀干預后p65活性明顯降低，早干預組表達降低比晚干預組更加明顯，見Tab 6，Fig 4。

Tab 6 Change after heart failure and effect of simvastatin on cardiomyocyte nuclear p65 activity(±s，n=6)

Tab 6 Change after heart failure and effect of simvastatin on cardiomyocyte nuclear p65 activity(±s，n=6)

**P＜0.01 vs groupⅠ;△△P＜0.01 vs groupⅡ;#P＜0.05 vs groupⅣ

GroupⅠ GroupⅡ GroupⅢ GroupⅣp65 2464.97±130.09 6922.76±358.44**2897.18±263.71△△#4368.54±180.62△△

Fig 4 EMSA of cardiomyocyte nuclear p65 activity in four groups(n=6)The p65 activity of cardiomyocyte nuclear was increased in failure heart(groupⅡ)，simvastatin inhibited the p65 activity of cardiomyocyte nuclear(groupⅢ，groupⅣ)

3 討論

成年心臟心肌代謝主要依靠線粒體氧化長鏈脂肪酸，參與脂肪氧化酶的基因受PPARs調節［7］。最近的研究發現，心肌肥厚與心肌代謝發生改變、脂肪氧化減少，葡萄糖氧化增加有關，而這樣的代謝為胎兒心肌的代謝特點。這一變化被認為是為減少耗氧而發生的適應性反應，但因受損的脂肪酸氧化而導致脂質在心臟沉積，并導致心肌肥厚［8］。

許多研究顯示PPARγ對心肌肥厚、心肌纖維化具有抑制作用，抑制細胞表面積增大及心肌肥厚相關基因的表達。抑制心肌肥厚及間質纖維化，改善心肌重構。Yuan等［9］在大鼠中研究顯示，PPARγ抑制心肌細胞增長、胚胎基因表達，并抑制NF-κB的活性。Yamamoto等［10］在研究中也發現，PPARγ激活抑制NF-κB激活，抑制心肌肥厚發生。

核因子-κB(nuclear factor kappa B，NF-κB)是一種具有基因轉錄多向調控作用的核轉錄因子，NF-κB存在于血管內皮細胞、血管平滑肌細胞及心肌細胞，在心肌肥厚、心肌細胞凋亡、心力衰竭的發生中，發揮重要作用［11］。內分泌-細胞因子引起的心室重構、心室肥厚的信號通路最終都經過NF-κB［12］。

近期研究證明［13］，他汀類藥物對抑制心室重構，改善心功能有重要作用，其機制與激活PPARγ［14，15］，抑制 NF-κB 活性有關。Delerive 等［15］在研究中發現，PPARα與NF-κB亞單位p65第12-317號氨基酸有弱的相互作用，通過蛋白-蛋白作用，PPARα 對 NF-κB 產生抑制作用。Planavila等［16］研究也發現，在壓力負荷增加導致的心肌肥厚過程中，Atorvastatin干預抑制了NF-κB激活，并防止了PPARs蛋白表達降低，抑制心肌肥厚的發生。

與以往研究結果相似［5，15］，本研究結果顯示在壓力負荷及容量負荷增加導致的心力衰竭心肌組織中，心肌細胞核PPARγ蛋白表達較假手術組明顯減少，RT-PCR分析顯示心力衰竭心肌組織細胞核中PPARγ mRNA表達降低，而心肌細胞核NF-κB亞基p65蛋白表達增加，電泳移動轉變分析(EMSA)顯示，心力衰竭心肌組織中，p65活性較健康對照明顯增強。表明PPARγ表達減少，對心肌肥厚的抑制作用減弱，導致心肌肥厚發生，p65表達增加、活性增強是心肌肥厚的重要原因，PPARγ與p65存在負向調節關系。辛伐他汀干預后 PPARγ mRNA、蛋白表達增加，細胞核p65表達減少，活性降低，表明辛伐他汀通過調節轉錄，提高PPARγ表達，PPARγ表達增加抑制p65表達及活性，從而對心肌肥厚產生影響。比較早干預組與晚干預組發現，早干預使PPARγ mRNA表達增加比晚干預組更加明顯，且早干預組對p65活性抑制比晚干預組更強。

［1］Schoonjans K，Martin G，Staels Auwerx J.Peroxisome proliferatoractivated receptors，orphans with ligands and functions［J］.Curr Opin Lipidol，1997，8(3):159-66.

［2］Chawla A，Repa J J，Evans R M，et al.Nuclear receptors and lipid physiology:opening the X-files［J］.Science，2001，294(5548):1866-70.

［3］Purcell N H，Tang G L，Yu C F，et al.Activation of NF-kappa B is required for hypertrophic growth of primary rat neonatal ventricular cardiomyocytes［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2001，98(12):6668-73.

［4］Higuchi Y，Otsu K，Nishida S，et al.Involvement of reactive oxygen species-mediated NF-kappa B activation in TNF-alpha-induced cardiomyocyte hypertrophy［J］.J Mol Cell Cardiol，2002，34(2):233-40.

［5］Asakawa M，Takano H，Nagai T，et al.Perexisome proliferator-activated receptor γ plays a critical role in inhibition of cardiac hypertrophyin vitroandin vivo［J］.Circulation，2002，105(10):1240-46.

［6］鄒 操，劉志華，趙彩明，等.超容量負荷聯合壓力負荷制備家兔心衰模型的可行性探討［J］.實驗動物與比較醫學，2005，4(25):248-54.

［6］Zou C，Liu Z H，Zhao C M，et al.A model of heart failure induced by volume plus pressure overload in rabbits［J］.Lab Anim Comp Med，2005，4(25):248-54.

［7］Tian Q，Barger P M.Deranged energy substrate metabolism in the failing heart［J］.Curr Hypertens Rep，2006，8(6):465-71.

［8］Barger P M，Brandt J M，Leone T C，et al.Deactivation of peroxisome proliferator-activated receptor-alpha during cardiac hypertrophic growth［J］.J Clin Invest，2000，105(12):1723-30.

［9］Yuan Z，Liu Y，Liu Y，et al.Cardioprotective effects of peroxisome proliferator activated receptor γ activators on acute myocarditis:anti-inflammatory actions associated with nuclear factor kB blockade［J］.Heart，2005，91(9):1203-8.

［10］Yamamoto K，Ohki R，Lee R，et al.Peroxisome proliferator-activated receptorγ activators inhibit cardiac hypertrophy in cardiac myocytes［J］.Circulation，2001，104(14):1670-5.

［11］Hirotani S，Otsu K，Nishida K，et al.Involvement of nuclear factor-Kappa B and apoptosis signal-regulating kinase 1 in G-proteincoupled receptor agonist-induced cardiomyocyte hypertrophy［J］.Circulation，2002，105(4):509-15.

［12］Li Y，Ha T，Gao X，et al.NF-κB activation is required for the development of cardiac hypertrophyin vivo［J］.Am J Physiol Heart Circ Physiol，2004，287(4):H1712-20.

［13］胥雪蓮，覃 數，雷 寒，等.辛伐他汀改善大鼠心肌梗死后心室重塑與 p-ERK1/2的關系［J］.中國藥理學通報，2008，24(2):258-61.

［13］Xu X L，Qin S，Lei H，et al.Simvastatin ameliorates rat ventricular remodeling after myocardial infarction:the role of phosphorylating extracellular signal-regulated kinase1/2［J］.Chin Pharmacol Bull，2008，24(2):258-61.

［14］Planavila A，Laguna J C，V?zquez-Carrera M.Atorvastatin improves peroxisome proliferator-activated receptor signaling in cardiac hypertrophy preventing nuclear factor-κB activation［J］.Biochim Biophys Acta，2005，1687(1-3):76-83.

［15］Delerive P，De Bosscher K，Sandrine B，et al.Peroxisome proliferator-activated receptor a negatively regulates the vascular inflammatory gene response by negatively regulates the vascular inflammatory gene response by negative cross-talk with transcription factors NF-κB and AP-1［J］.J Biol Chem，1999，5274(45):32048-54.

［16］Planavila A，Rodriguez-Calvo R，Jove M，et al.Peroxisome proliferator-activated receptor beta/delta activation inhibits hypertrophy in neonatal rat cardiomyocytes［J］.Cardiovasc Res，2005，65(4):832-41.