脈沖強光對大腸桿菌細胞膜損傷及胞內酶活性的影響

張佰清 郭佳佳

（沈陽農業大學食品學院，遼寧 沈陽 110161）

脈沖強光對大腸桿菌細胞膜損傷及胞內酶活性的影響

張佰清 郭佳佳

（沈陽農業大學食品學院，遼寧 沈陽 110161）

通過脈沖強光處理對數生長期大腸桿菌細胞懸液，研究菌體細胞膜通透性及胞內酶活性的變化。結果表明，蛋白質的漏出量及丙二醛的生成量均隨大腸桿菌存活率的下降而增加，在處理電壓1 500V、閃照次數32次的條件下，蛋白質漏出量為13.03μg/mL，丙二醛生成量為2.76nmol/L，對氯化鈉的耐受性明顯低于對照組（P＜0.01）。此外，胞內酶活性與處理前相比均有所降低，超氧化物歧化酶活性最低降至83.78%，過氧化氫酶活性最低降至76.92%。因此，細菌屏障結構破壞所造成的細胞膜滲透壓及通透性改變，可使細菌胞內物質發生改變，甚至導致菌體死亡，羥自由基可能對致死細胞的協同作用有一定的意義。

脈沖強光；大腸桿菌；細胞膜損傷；胞內酶活性

脈沖強光作為一種冷殺菌技術，是利用極強的直流電通過充有惰性氣體的燈管，發出比地面上太陽光強近2萬倍的光能，照射于食品表面，從而有效致死各種微生物［1］。該技術對食品的風味和營養成分影響很小，可有效的保持食品質量，延長貨架期。目前對其在微生物致死效果方面的研究較多，而對致死機理的報道較少。因此，選擇衛生檢測標準菌大腸桿菌進行試驗，通過研究細胞膜損傷及胞內抗氧化酶活性的變化，分析脈沖強光對微生物細胞產生的不同生物效應，從而為其致死機理提供理論依據［2］。

1 材料與方法

1.1 試驗儀器

電熱恒溫培養箱：DNP－9082型，上海精宏實驗設備有限公司；

數顯恒溫水浴鍋：HH－6型，國華電器有限公司；

紫外可見分光光度計：UV－2000型，尤尼科（上海）儀器有限公司；

臺式高速離心機：TG16－WS型，湘儀離心機儀器有限公司；

脈沖強光冷殺菌裝置：波長范圍為200～1100nm、光脈沖的脈沖寬度為20μs、最大輸入能量為644J，自行研制；

全溫振蕩培養箱：HZP－250型，上海精宏實驗設備有限公司；

電子天平：JY2002型，上海精密科學儀器有限公司；

手提式不銹鋼蒸氣消毒器：YX280A型，上海三申醫療器械有限公司；

超聲波細胞粉碎機：Y92－Ⅱ型，寧波新芝生物科技股份有限公司；

數字式酸度計：PHS－25型，上海日島科學儀器有限公司；

超凈工作臺：SZX－ZP型，上海博訊實業有限公司醫療設備廠。

1.2 試驗材料及試劑

大腸桿菌（E.coli）菌種：沈陽農業大學土地與環境學院微生物實驗室；

培養基：牛肉膏蛋白胨瓊脂培養基，LB液體培養基；

鹽酸、氫氧化鈉、乙醇（95%）、結晶牛血清蛋白、考馬斯亮藍G－250、磷酸（85%）、三氯醋酸、硫代巴比妥酸、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、三羥甲基氨基甲烷、丙三醇、二乙三氨五乙酸、鄰苯三酚、VC、30%H2O2等：分析純（AR），國藥集團化學試劑有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 脈沖強光處理 將搖瓶培養至對數生長期的E.coli懸液經5 000r/min離心10min得菌體沉淀，重新懸浮于50mmol/L磷酸緩沖液（pH 7.8）中，使菌懸液濃度約為109CFU/mL。在每個直徑為75mm的培養皿中加入6mL的菌懸液，放在殺菌處理室中央，按照試驗設置進行處理［3］。每個處理3次重復，結果取平均值。處理電壓：800，1 000，1 500，2 000，2 500V；閃照次數：4，8，16，24，32。

1.3.2 漏出蛋白質含量的測定 取脈沖強光處理后的菌懸液，4℃下以12 000r/min的轉速離心8min，得到的上清液為粗酶液，蛋白質含量的測定采用考馬斯亮藍染色法［4］。蛋白質滲漏量按式（1）計算：

蛋白質滲漏量＝試驗組蛋白含量－對照組蛋白含量（1）

1.3.3 脈沖強光與NaCl的協同作用 將未經處理的對照組及經脈沖強光處理后的菌懸液，分別接種在普通營養瓊脂培養基及另加質量分數為1%、3%、5%、7%、9%NaCl的普通營養瓊脂培養基上。置37℃溫箱培養24h，用平板計數法進行活菌計數，比較在不同NaCl含量培養基上的E.coli存活率。

1.3.4 殺菌效果與羥自由基（·OH）作用的觀察 用50mmol/L磷酸緩沖液（pH 7.8）懸浮E.coli菌體，經脈沖強光處理后以普通營養瓊脂平板涂布法活菌計數。另用1mol/L甘油懸浮菌體，脈沖強光處理后按前述方法活菌計數。殺菌率按式（2）計算：

1.3.5 細胞膜脂質過氧化產物的測定 參照陳勤的TBA法［5］并略加改進。脈沖強光處理后的菌懸液冰浴下用超聲波破碎細胞（功率600W，連續破碎5s，間隔30s，破碎15次），再于4℃下6 000r/min離心20min取上清液用于丙二醛（MDA）含量的測定。

1.3.6 胞內酶活性的測定 將破壁后的E.coli菌懸液于4℃下10 000r/min離心20min，上清液即為粗酶液。超氧化物歧化酶（SOD）活性測定采用改良的鄰苯三酚自氧化法，過氧化氫酶（CAT）活性測定采用Beers＆Sizers法，并做相應改進［6］。相對酶活性按式（3）計算：

2 結果與分析

2.1 漏出蛋白質含量的考察

蛋白質廣泛存在于細菌細胞壁、細胞膜及細胞質中，對細菌的生長代謝起著重要的作用。蛋白質嚴重受損，會直接導致菌體死亡。由表1可知，在閃照6次的條件下，漏出蛋白含量與處理電壓呈正相關，當處理電壓從1 000V到2 000V時，漏出蛋白含量明顯增加，當處理電壓超過2 000V時，增加緩慢；在處理電壓為1 500V的條件下，漏出蛋白含量與閃照次數呈正相關，當閃照次數從1次到8次時，漏出蛋白含量明顯增加，當閃照次數大于8次時，增加緩慢，當閃照次數為32次時，達到最高值13.03μg/mL。隨著脈沖強度的增加，漏出蛋白不斷增加，可能是脈沖強光作用于菌體胞壁或胞膜，使之通透性增加的結果。當脈沖強度過大時，曲線較低強度處理趨于平緩，這可能是因為高強度脈沖處理存活下來的菌體本身較少，故被殺滅的也少，致使漏出蛋白質含量的增加也減少。

表1 脈沖強光對E.coli漏出蛋白質含量的影響Table 1 Effect of pulsed light irradiation on the leakage of protein content of E.coli

2.2 對NaCl耐受性考察

E.coli經脈沖強光照射后，置NaCl溶液中，可加速其死亡。由圖1可知，經1 200V、閃照5次脈沖強光處理后的菌懸液對NaCl的耐受性明顯低于未經脈沖強光處理的對照組（P＜0.01），并且E.coli存活率隨著NaCl濃度的增高而顯著降低，當NaCl濃度為3%時，存活率已下降為31.5%。這可能是因為脈沖強光使菌體胞膜受到損傷，引起通透性增加，從而對潛在性抑制劑的敏感性增高，屏障作用有所降低，胞外高滲溶液更容易加速菌體的死亡。

2.3 ·OH生成量對殺菌效果的影響

由于菌體處于水環境中，故·OH是主要的自由基。·OH是一種非常活躍的自由基，可導致細胞膜成分的過氧化，從而引起細胞膜流動性、通透性、不對稱性和完整性的破壞，致使細胞死亡。

由圖2、圖3可知，E.coli的存活率與脈沖強度的增加呈負相關。在閃照5次的條件下，存活率隨處理電壓的增大而降低，處理電壓為1 500V時，存活率僅為5.92%；在處理電壓為1 200V的條件下，存活率隨閃照次數的增大而降低，閃照8次，存活率已降低到8.62%。當1mol/L甘油俘獲·OH后E.coli的存活率均有所增加，但差異不顯著（P＞0.05）。加入甘油后，E.coli存活率高于對照組，這是因為甘油俘獲·OH后使其不能攻擊菌體或攻擊作用減少，也就是說菌體死亡一部分是·OH生成的結果。但這并不是脈沖強光致死微生物的主要原因。

圖1 脈沖強光作用后E.coli對NaCl的耐受性變化Figure 1 Effect in NaCl tolerance of E.coli after pulsed light irradiation

圖2 處理電壓對E.coli存活率的影響Figure 2 Effect of treatment voltage on the survival rate of E.coli

圖3 閃照次數對E.coli存活率的影響Figure 3 Effect of irradiation times on the survival rate of E.coli

2.4 脈沖強光作用與MDA生成量的關系

機體產生的氧自由基能通過脂質過氧化物的分解產物改變細胞膜的流動性和滲透性，引起細胞損傷。因而MDA的含量常常可以反映機體內脂質過氧化的程度，間接地反映出細胞損傷的程度。

由表2可知，在閃照5次的條件下，MDA的生成量隨處理電壓的增大而增多；在處理電壓為1 500V的條件下，MDA的生成量隨閃照次數的增大而增多。測定結果表明，脈沖強光可使E.coli脂質過氧化，MDA的生成量與E.coli存活率相關。

表2 脈沖強光作用后E.coli胞內MDA生成量檢測Table 2 Change of MDA in E.coli after pulsed light irradiation

2.5 胞內酶活性的變化

由于氧化應激態會造成細胞的損傷，而抗氧化酶系則可清除自由基，預防氧化應激態的發生。SOD、CAT是抗氧化酶系的兩種基礎代謝酶，通過檢測其活性變化來反映脈沖強光對E.coli處理后細胞損傷狀況。表3，表4分別顯示的是脈沖強光作用后E.coli胞內SOD和CAT的活性變化。

表3 脈沖強光作用后E.coli胞內SOD活性變化Table 3 Change of SOD activity in E.coli after pulsed light irradiation

表4 脈沖強光作用后E.coli胞內CAT活性變化Table 4 Change of CAT activity in E.coli after pulsed light irradiation

由表3、表4可知，隨著脈沖強度的增大，SOD和CAT的活性都有所降低，但這種降低幅度不大。在處理電壓為1 200V的條件下，閃照32次時，SOD活性降低了14.49%；在處理電壓為2 000V的條件下，閃照40次時，CAT活性降低了23.08%。SOD和CAT是細胞內重要的抗氧化酶，它們的失活應該不是細胞死亡直接引起的，因為細胞死亡后細胞內的酶應該是逐漸失活的，而電壓800V、閃照4次的脈沖條件處理后就己經能夠使細胞內的酶活性有所降低了。

3 結論

隨著脈沖強度的增加，蛋白質漏出量和MDA生成量均有所增加，在處理電壓為1 500V、閃照次數由4次增加至32次的條件下，蛋白質漏出量由6.75μg/mL增加至13.03μg/mL，MDA生成量由1.46nmol/L增加至2.76nmol/L；對NaCl的耐受性明顯低于對照組，當NaCl濃度為9%時，對照組的存活率為88.4%，而脈沖組的存活率僅為4.8%。菌懸液中·OH與未經脈沖強光處理的相比較有所增加，胞內抗氧化酶活性降低，SOD活性最低降至83.78%，CAT活性最低降至76.92%。以上數據表明，脈沖強光處理對E.coli的細胞膜造成了嚴重損傷，并大幅降低了胞內酶的活性，這也可能是E.coli致死的主要原因之一。

1 周萬龍，高大維.脈沖強光殺菌技術的研究［J］.食品科學，1998（1）：16～19.

2 Dunn J，Ott T，Clark W.Pulsed－light treatment of food and packaging［J］.Food Technology，1995（9）：95～98.

3 錢存柔.微生物學實驗［M］.北京：北京大學出版社，1985：176.

4 陳雅蕙，袁明秀.生物化學實驗原理和方法［M］.北京：北京大學出版社，2006：240～242.

5 陳勤.抗衰老的研究方法［M］.北京：中國醫學科技出版社，1996：485～490.

6 施特爾馬赫.酶的測定方法［M］.錢嘉淵，譯.北京：中國輕工業出版社，1992：186～188.

Damage ofE.colicell membrane and intracellular enzymic activity induced by pulsed light irradiation

ZHANG Bai－qingGUO Jia－jia

（Food Science College of Shenyang Agricultural University，Shenyang，Liaoning110161，China）

After pulsed light treatment on the suspension ofE.coliin logarithmic growth phase，research the change of cell membrane permeability and intracellular enzymic activity.The result indicated that protein leakage and MDA formation increased with the decline of the survival rate ofE.coli.Through pilot studies，drawn input voltage to 1 500V，flash as 32times，the leakage of protein was 13.03μg/mL and the formation amount of MDA was 2.76nmol/L.NaCl tolerance was obviously lower than the control group（P＜0.01）.In addition，intracellular enzymic activity lower than untreated，SOD was decreased to 83.78%as well as CAT was decreased to 76.92%.Therefore，the damage of cell barrier structure caused the change of osmotic pressure and cell membranes permeability.It can change intracellular bacterial substances even it caused cell died.It would be certain meaning that synergistic reaction which hydroxyl radicals acted on lethality cell.

pulsed light；E.coli；membrane damage；intracellular enzymic activity

10.3969 /j.issn.1003－5788.2010.05.017

張佰清（1966－），男，沈陽農業大學副教授。E－mail：sybaiqingxl＠sina.com

2010－06－11