基于16S rRNA和recA香魚鰻利斯頓氏菌的分離鑒定

王成義，閆茂倉，陳少波，管敏鑫，單樂州，艾為明，謝起浪，蔡延馬奔

(1.溫州醫學院生命科學學院, 浙江 溫州 325005；2.浙江省海洋水產養殖研究所，浙江 溫州 325005；

3.浙江省近岸水域生物資源開發與保護重點實驗室，浙江 溫州 325005；4.Division of Human Genetics and Center for Hearing and Deafness Research, Cincinnati Children’s Hospital Medical Center, Cincinnati, Ohio 45229, USA; 5.溫州市工業科學研究院，浙江 溫州 325028）

基于16S rRNA和recA香魚鰻利斯頓氏菌的分離鑒定

王成義1,2,3，閆茂倉2,3，陳少波2,3，管敏鑫1,4，單樂州2,3，艾為明1，謝起浪2,3，蔡延馬奔5

(1.溫州醫學院生命科學學院, 浙江 溫州 325005；2.浙江省海洋水產養殖研究所，浙江 溫州 325005；

3.浙江省近岸水域生物資源開發與保護重點實驗室，浙江 溫州 325005；4.Division of Human Genetics and Center for Hearing and Deafness Research, Cincinnati Children’s Hospital Medical Center, Cincinnati, Ohio 45229, USA; 5.溫州市工業科學研究院，浙江 溫州 325028）

為研究引起香魚(Plecoglossus altivelis)出血潰爛癥病因及致病菌系統發育地位，本研究從患病香魚的肝臟、腎臟及體表分離到11株病原菌（編號：X0901-X0911），運用常規細菌生理生化方法鑒定致病菌所屬種類；運用16S rRNA基因、recA基因序列分析方法研究致病菌的系統發育地位。細菌生理生化鑒定結果表明：致病菌為鰻利斯頓氏菌，11株細菌生理生化結果相同，均為革蘭氏陰性桿菌、氧化酶陽性、接觸酶陽性、吲哚陽性、精氨酸脫羧酶陽性、精氨酸雙水解酶陽性、硝酸鹽還原陽性、甘露醇陽性、MR測定陽性；H2S陰性、V-P測定陰性等。根據16S rRNA基因、recA基因序列分別構建弧菌科常見細菌系統進化樹，結果表明：致病菌與鰻利斯頓氏菌（Listonella anguillarum）均聚為一枝，聚類結果與細菌生理生化鑒定結果相符。致病菌與鰻利斯頓氏菌16S rRNA基因、recA基因的同源性分別為99.9%、99.8%。以recA基因構建的系統進化樹的拓撲學結構與16S rRNA基因建樹結果相類似。此外，與16S rRNA基因相比，recA基因在不同物種之間具有更高的鑒別能力，本研究表明recA基因適合作為弧菌科常見細菌物種間進化關系研究的標記。

香魚; 鰻利斯頓氏菌; 分離; 鑒定

引 言

香魚 (Plecoglossus altivelis) 隸屬于鮭形目，香魚科，香魚屬。是一種小型名貴經濟魚類，在當今國際市場上享有“淡水魚之王”的美稱，由于工業的發展及人為的濫捕，造成天然香魚種群日益減少，目前已處于瀕危的狀態，被國家列為二級保護動物。1998年發布的《中國瀕危動物紅皮書》把香魚列入易危動物[1]。在香魚高密度人工養殖過程中極易出現病害，特別是在香魚幼苗階段易出現由鰻利斯頓氏菌（原：鰻弧菌vibrio anguillarum）、假單胞菌 (Pseudomonassp.)、鏈球菌 (Streptococcussp.）、柱狀屈撓桿菌 （Flexibacter columnaris）、殺魚巴斯德菌 (Past.Piscicida) 等引起的細菌性疾病，其中尤其以鰻利斯頓氏菌引發的出血潰爛病的影響最為嚴重[2]。

鰻利斯頓氏菌是一類革蘭氏陰性菌，最早于1761年發現于歐洲，Bonaveri[3]將該病描述為紅疫病，曾在18-19世紀意大利的海水養殖鰻鱺中流行，造成嚴重死亡。1909年，Bergman[4]從瑞典沿海養殖的患紅疫病鰻鱺中分離到病原菌，并將其命名為鰻弧菌。MacDonnell和Colwell[5]在1985年將歸屬到利斯頓菌屬(Listonella)。鰻利斯頓氏菌是一種條件致病菌，能夠引起多種水產動物疾病，如：鮭魚 (Stenodus leucichthys)、虹鱒 (Salmo grairdneri)、鰻鱺、香魚、鱸魚 (Lateolabrax japonicus)、鱈魚 (Gadus callarisa)、大菱鲆 (Scophthatmus maximus)、牙鲆 (Paralichthys olivaceus)、大黃魚 (Pseudosciaena crocea) 等[4,6-11]。

迄今為止，在細菌鑒定及系統發育地位研究方面，16S rRNA依然是最常用的分子工具。細菌分類學家普遍認為16S rRNA的同源性大于97.5%的細菌可視為同種[12]，然而弧菌科許多不同種細菌的同源性大于97.5%[13]，已經不能準確的確定待測菌株的系統分類學地位。在這種前提下，許多學者將視線轉移到其他的持家基因作為系統分類學研究工具[14,15]。Zeigler[16]研究指出單個基因也可以很好的預測整個基因組的系統發育關系。recA基因是廣泛存在于細菌中重要的持家基因，編碼一種多功能蛋白質，其功能主要涉及：同源重組、DNA修復、SOS反應、單鏈DNA結合、DNA解螺旋、同源重組中尋找同源位點[17,18]。recA基因被用于研究Burkholderia屬所有細菌的分類，證明是有效的鑒定工具[19]。Thompson等[14]利用recA做標記研究弧菌科細菌的系統發育關系，表明recA基因比16S rRNA具有更好的辨別能力，適合做為弧菌科細菌鑒定的工具。

本研究運用傳統的細菌鑒定方法和16S rRNA基因和recA基因序列分析相結合的方法研究了引起香魚出血潰爛病致病菌的系統分類學地位。目的在于研究香魚的出血潰爛癥的病因，為香魚健康養殖提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、香魚 菌株分離自典型的出血潰爛癥狀的香魚；患病香魚采自樂清市某香魚育苗場，健康香魚來自浙江省海洋水產養殖研究所清江試驗場。

1.1.2 試劑 PCR擴增試劑盒、DL2000分子量標準、UNIQ-10柱式細菌基因組DNA抽提試劑盒（SK1202）均購自上海生工生物工程技術服務有限公司，細菌鑒定管購自杭州天和微生物有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細菌的分離鑒定 取患出血病瀕臨死亡的香魚，用70%酒精消毒體表，用無菌的剪刀剪破病魚的體腔壁，在無菌條件下挑取肝胰臟、腎臟接種于ZOBELL 2216E和TCBS培養基，將平板置于30℃條件下培養24 h挑取形態一致的優勢菌落，進一步劃線純化，經純化培養后轉接到ZOBELL 2216E海水斜面

培養基上，于4℃保存、備用。

1.2.2 人工感染試驗 選取純化后的4株代表細菌用于人工感染試驗，方法是將供試菌株分別接種于ZOBELL 2216E海水培養基試管斜面，于30℃培養18 h，加入0.65%無菌的生理鹽水沖洗菌落，配成菌懸液調整細菌濃度約為5.2×108個/mL，每尾香魚胸腔注射0.2 mL菌液；另設對照組，每尾魚注射相同劑量0.65%的無菌生理鹽水，每組香魚的數量為10尾。注射后觀察香魚的發病死亡情況，并對死亡香魚及時剖檢和致病菌的再次分離。

1.2.3 形態觀察及生理生化鑒定 觀察致病菌ZOBELL 2216E和TCBS培養基平板的菌落的形態特征，分別取11株致病菌的ZOBELL 2216E海水培養基試管斜面30℃的18 h培養物，制備相應的涂片，革蘭氏染色，顯微鏡下觀察個體形態、大小。按傳統的細菌鑒定方法較系統地測定致病菌相關的理化特征指標。1.2.4 致病菌基因組DNA提取 將致病菌株分別接種于ZOBELL 2216E海水培養基試管斜面，于30℃培養18 h，加入0.65%無菌的生理鹽水沖洗菌落，配置成為菌懸液。后依據UNIQ-10柱式細菌基因組DNA抽提試劑盒說明書所示方法提取致病菌的總DNA。基因組DNA于1%瓊脂糖凝膠電泳檢測模板的純度和完整性。

1.2.5 16S rRNA基因和recA基因的PCR擴增、測序 使用primer premier5.0軟件設計鰻利斯頓氏菌recA基因的特異性引物,并使用16S rRNA基因細菌通用引物擴增，引物如表1所示。16S rRNA基因和recA基因50μl擴增反應體系中含有：5 μl 10×buffer，MgCl22 mM，引物各0.2 μM，dNTPs各0.25 mM，Taq DNA聚合酶1.25 U，模板DNA約50 ng。反應在熱循環儀上進行，16S rRNA擴增的循環參數為：94 ℃預變性10 min、94 ℃變性30 s、55 ℃復性45 s、72 ℃延伸90 s，35個循環后72 ℃保溫10 min。recA基因擴增的循環參數為：94 ℃預變性10 min、94 ℃變性30 s、55 ℃復性45 s、72 ℃延伸40 s，35個循環后72 ℃保溫10 min。反應完畢后分別取5 μl于1%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統下分析結果。PCR擴增產物送交上海生物工程技術公司測序。1.2.6 序列分析及數據處理 通過Blast軟件從GenBank數據庫中檢索與16S rRNA基因和recA基因同源性較高的細菌基因序列，并從中選取與所待測細菌16S rRNA基因和recA基因同源序列，采用Clustal X 2.0軟件[20]進行多序列匹配排列（Multiple Alignments），采用RDP3.34軟件檢測recA基因同源序列之間的基因重組事件。使用DNASTAR軟件分別計算16S rRNA基因和recA基因的序列相似性。用系統發生推斷軟件包MEGA4.0[21]進行系統發育分析，計算recA基因的GC含量和堿基置換和顛換的比例；在Kimura-2-parameter 模型的基礎上，用Neighbor-joining 法分別構建分子系統樹，自舉分析（Bootstrap）1000次重復檢測分子系統樹的置信度，缺失和不確定的位點在計算中被省略，使用其他的建樹方法構建進化樹比較確定NJ樹聚類關系的準確性。

表1 PCR擴增的引物Tab.1 the primers used in the PCR amplifications

2 結 果

2.1 細菌分離

從上述患病香魚的肝胰臟和腎臟中分離得到的細菌，在ZOBELL 2216E和TCBS培養基平板上分別得到形態特征相似的菌落。經過3次的平板劃線純化得到11株細菌其編號分別為：X0901至X0911。將純化后的細菌接種于ZOBELL 2216E海水培養基試管斜面，30℃培養18 h后，于4℃冰箱中保存供鑒定和基因組DNA提取使用。

2.2 人工感染試驗

自然發病的香魚體表充血潰爛、肛門紅腫、腹部腫脹等。香魚在接種菌懸液后12 h內全部發病死亡；對照組的10尾香魚養殖觀察10 d均正常存活。剖檢可見接種菌懸液香魚臨床特征與自然病例樣類似但癥狀較輕。以菌液感染死亡的香魚肝胰臟和腎臟為材料，通過平板分離純化的細菌與供試菌類似，對健康的香魚進行重復感染，同樣可得到與自然病例樣類似但臨床癥狀較輕的病變。供試菌為香魚出血潰爛病的病原菌。

2.3 形態及菌落特征

2.4 生理生化特征

對致原菌作生化管鑒定，內容和結果見表1。11株細菌的生理生化特征完全相同，均為氧化酶陽性、接觸酶陽性、甘露醇陽性、吲哚陽性、硝酸鹽還原陽性、MR測定陽性、精氨酸脫羧酶陽性、精氨酸雙水解酶陽性；VP測定為陰性；利用葡萄糖、甘露糖和蔗糖產酸，參考《伯杰鑒定細菌學手冊》（第9版）[22]得知與鰻利斯頓氏菌的生理生化特征非常相似。

表2 分離菌株的生理生化特征Tab.2 Biochemical and physiological characteristics of Strains

2.5 細菌DNA提取結果及擴增

細菌基因組DNA的純度和完整性較好適合作PCR擴增模板。16S rRNA基因和recA基因的電泳結果如圖1所示。11株致病菌的16S rRNA基因和recA基因序列測定結果完全相同，表明11株致病菌屬于同種細菌，序列已提交到GeneBank數據庫，登錄號分別為：GQ4098612、GQ409861。

16S rRNA基因擴增片段的長度為1 393 bp，約占16S rRNA基因總長度的93%，擴增片段的GC含量為54.4%。用于建樹的16S rRNA基因置換與顛換的比率k（嘌呤）= 1.719；k（嘧啶）= 3.084，置換顛換的總體偏差R=1.172。recA基因擴增片段長度為534 bp，約占recA基因總長度的50%，擴增片段的GC含量為45.3%。用于建樹的recA基因置換與顛換的比率k（嘌呤）=2.646；k（嘧啶）= 3.796，置換顛換的總體偏差R=1.513。DNASTAR計算得出致病菌16S rRNA基因與鰻利斯頓氏菌16S rRNA基因的同源性大于99.9%；recA的同源性為99.8%。使用RDP3.34軟件并沒有檢測到不同物種之間存在基因重組事件。利用16S rRNA基因和recA基因構建的進化樹的結果如圖2、圖3所示。

圖 1 16S rRNA基因和recA基因PCR擴增產物電泳結果

圖 2 根據16 S rRNA基因序列構建的系統發育樹Fig.2 Molecular phylogenetic tree based on 16 S rRNA gene sequences

圖 3 根據recA基因構建序列構建的系統發育樹Fig.3 Molecular phylogenetic tree based on recA gene sequences

3 討 論

本實驗從出血潰爛病香魚體內分離出11株致病菌，通過對致病菌的生理生化特征鑒定表明致病菌為鰻利斯頓氏菌。在細菌的系統發育地位研究方面，16S rRNA基因是最主要的分子工具，被廣泛的應用于各種微生物系統發育地位研究。細菌分類學家普遍認為16S rRNA的同源性大于97.5%的細菌可視為同種。

隨著新物種的發現，許多不同物種之間16S rRNA的同源性遠大于97.5%，已不能夠準確反映它們發育學地位。在這種前提下，國內外學者紛紛將視線轉移到其他靶位點。Zeigler[16]提出用于系統發育研究的靶基因應該滿足4個標準，即：1.靶基因必須廣泛的分布于所有生物的基因組中；2.靶基因必須在給定物種的基因組中只出現一次；3.靶基因序列必須足夠長，包含足夠的信息，以及便于測序研究；4.序列必須能夠預測所有物種的親緣關系，并具有可以接受的精度和準確度，聚類結果與16S rRNA的鑒定結果和DNA

分子雜交結果相符。同時指出單個基因也可以很好的預測整個基因組的系統發育關系。recA基因是廣泛存在于細菌中重要的持家基因，編碼一種多功能蛋白質[17,18]。recA基因被用于研究Burkholderia屬所有細菌的分類，證明是有效的鑒定工具[19]。Thompson等[14]利用recA做標記研究弧菌科細菌的系統發育關系，表明recA基因比16S rRNA具有更好的辨別能力，適合做為弧菌科細菌鑒定的工具。本研究為進一步確定致病菌的系統發育學地位，我們使用細菌16S rRNA通用引物并設計鰻利斯頓氏菌recA基因的特異性引物，擴增了致病菌的16S rRNA基因和recA基因的部分片段，并分別構建系統發育樹。建樹結果表明致病菌均能夠和鰻利斯頓氏菌聚為一類，16S rRNA基因和recA基因的序列同源性分別為99.9%和99.8%，聚類結果與生理生化鑒定結果相一致。比較兩株進化樹可以得知相同弧菌在進化樹上的拓撲學位置大致相符合。

Listonella anguillarum與Vibrio ordalii具有極近的親緣關系，16S rRNA基因和recA基因的序列同源性分別為99.0%、97.6%，這一結果和DNA雜交試驗得出的結論相一致[23]；Vibrio cholerae與Vibrio mimicus親緣關系較近，但是比較兩株進化樹可知它們的發育學地位并不完全一致，根據16S rRNA基因構樹結果兩種不同的細菌混雜在一起，而依據recA基因建樹的結果能夠把兩種不同的細菌分開，Vibrio cholerae與Vibrio mimicus的16S rRNA基因和recA基因的序列同源性分別為99.4% ～ 99.6%、92.3% ～ 93.1%。Vibrio

parahaemolyticus、Vibrio alginolyticus、Vibrio harveyi和Vibrio campbellii四種細菌的親緣關系相對較近，建樹結果均可以將它們聚為一枝，但是Vibrio harveyi在16S rRNA構建的進化樹中并沒有彼此聚在一起，產生這種結果的原因是由于這4株細菌的16S rRNA的序列彼此之間同源性大于99%，建樹方法已無法對它們分類學地位作出準確的估計。在以recA基因構建的進化樹中Vibrio parahaemolyticus（EU051553）和Vibrio alginolyticus聚在一起，產生這種結果的原因尚不明確，需要做進一步研究確定這兩種菌的分類地位。Vibrio fluvialis和Vibrio vulnificus的拓撲學結構并不相符，產生這種情況可能的原因有兩種，一是“長枝吸引效應”，是指在用系統發育分析方法分析一個有限數據集時, 由于高頻率的相似變化(如趨同、平行進化)和加速的進化速率等因素的存在使序列達到相同狀態而人為地將這些不是來自于共同祖先的序列的代表分類元聚在一起, 使這些分類元之間相互“吸引”[24]。在使用外圍集團確定樹根的過程中，一個明顯距離很遠的外圍集團很可能會擁有一個分歧非常大的序列，以至于內部集團將受到長樹枝效應的影響，把這個序列同內部集團放在一起[25]。二是recA片段提供的進化信息不足，以致出現分類學地位模糊的現象。對上述結果產生的原因還需要再做進一步的研究?？傮w來說：與16S rRNA基因相比，recA基因在弧菌科常見細菌的系統發育地位分析中具有更好的鑒別能力。

[1]國家環保局, 中華人民共和國瀕危物種科學委員會.中國瀕危動物紅皮書（魚類）[M].北京: 科學出版社, 1998, 47-49.

[2]葉巖豹.香魚增養殖技術 [M].杭州: 浙江科學技術出版社, 2004.

[3]Bonaveri G F.Quoted in Drouln de Bouville R.de Les maladies des poissons d'eau douce d'Europe [J].Annal Sc.Agronom, 1907, 1: 120-250.

[4]Bergman A M.Die rote Beulenkrankheit des Aals Ber Kgl Bayer [J].Biol Verssta, 1909, 2: 10-54.

[5]MacDonell M T, Colwell R R.Phylogeny of theVibrionaceae, and recommendation of two new genera,ListonellaandShewanella[J].Syst Appl Microbiol, 1985, 6: 171-182.

[6]Toranzo A E, Santos Y, Lemos M L.Homology ofVibrioan anguillarumstrains causing epizooticsin turbot salmon and trout reared on the Atlantic coast of Spain [J].Aquaculture, 1987, (67): 41-52.

[7]肖慧, 李軍, 王祥紅, 等.鱸魚苗爛鰓、爛尾病病原菌的研究 [J].青島海洋大學學報, 1999, 29(1): 87-93.

[8]E Myhr, J L Larsen, A Lillehaug, et al.Characterization ofVibrio anguillarumand closely related species isolated from farmed fish in Norway [J].Appl Environ Microbiol, 1991 September; 57(9): 2 750-2 757.

[9]莫照蘭, 茅云翔, 陳師勇, 等.一株牙鲆皮膚潰爛癥病原菌的鑒定 [J].微生物學報, 2002, 42(3): 263-265.

[10]張曉君, 秦國民, 陳翠珍, 等.大菱鲆病原鰻利斯頓氏菌的藥物敏感性測定與分析 [J].海洋通報, 2008, 27(5): 35-38.

[11]李清祿, 陳強.海水網箱養殖大黃魚細菌性病原鑒定與感染治療研究 [J].應用于環境生物學報, 2001, 7(5): 489-493.

[12]塞文嬰, 東秀珠.定向進化同源基因在細菌系統進化研究中的應用 [J].微生物學通報, 2000, 27(5): 377-381.

[13]李寧求, 白俊杰, 吳淑勤, 等.斜帶石斑魚3種致病性弧菌的分子生物學鑒定 [J].水產學報, 2005, 20(3): 356-361.

[14]Thompson C C, Thompson K, Vandemeulebroecke K, et al. Use of recA as an alternative phylogenetic marker in the family Vibrionaceae [J].International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology.2004, 54, 919-924.

[15]Thompson F L, Gevers D, Thompson C C, et al.Phylogeny and Molecular Identification of Vibrios on the Basis of Multilocus Sequence Analysis [J].Applied And Environmental Microbiology.Sept.2005, 71(9): 5 107-5 115.

[16]Zeigler D R.Gene sequences useful for predicting relatedness of whole genomes in bacteria [J].Int J Syst Evol Microbiol.2003, 53, 1 893-1 900.

[17]Cox M M.The bacterial recA protein as a motor protein [J].Annu Rev Microbiol.2003, 57: 551-577.

[18]Lloyd A T, Sharp P M.Evolution of the recA gene and the molecular phylogeny of bacteria [J].J Mol Evol.1993, 37, 399-407.

[19]Mahenthiralingam E, J Bischof, S K Byrne, et al.DNA-Based diagnostic approaches for identification ofBurkholderia cepacia complex,Burkholderia vietnamiensis,Burkholderia multivorans,Burkholderia stabilis, andBurkholderia cepaciagenomovars I and III [J].J Clin Microbiol, 2000, 38: 3 165-3 173.

[20]Thompson J D, Gibson T J, Plewniak F, et al.The ClustalX windows interface: flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools [J].Nucleic Acids Research, 1997, 25: 4 876-4 882.

[21]Tamura K, Dudley J, Nei M, et al.MEGA4: Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA) software version 4.0 [J].Molecular Biology and Evolution.2007, 24: 1 596-1 599.

[22]Holt J G, Krieg N G, Sneath P H A, et al.Bergey’s manual of determinative bacteriology, 9th Edition [M].Baltimore: Williams and Wilkins, 1994.382-390.

[23]J J Farmer.The family Vibrionaceae [M].Prokaryotes.2006.6: 495-507.

[24]黎一葦, 于黎, 張亞平.系統發育研究中“長枝吸引”假象概述 [J].遺傳, 2007, 29(6): 659-667.

[25]Andreas D, Baxevanis B F.Francis Ouellette.生物信息學 基因和蛋白質分析的實用指南 [M].清華大學出版社, 2000.1: 176-208.

Isolation and identification ofListonella anguillarumfromPlecoglossus altivelisbased on 16S rRNA and recA

WANG Cheng-yi1,2,3，YAN Mao-cang2,3，CHEN Shao-bo2,3，GUAN Min-xin1,4，SHAN Le-zhou2,3，AI Wei-ming1，XIE Qi-lang2,3，CAI Yan-ben5

(1.Wenzhou Medical College, 325005, China; 2.Zhejiang Mariculture Research Institute, 325005, China; 3.Zhejiang Key Laboratory of Exploitation and Preservation of Coastal Bio-resource, 325005, China; 4.Division of Human Genetics and Center for Hearing and Deafness Research, Cincinnati Children’s Hospital Medical Center, Cincinnati, Ohio 45229, USA; 5.Wenzhou Engineering Graduate School, 325028, China）

In order to investigate the pathogen of bleeding ulcers ofPlecoglossus altivelisand the phylogenetic position of this pathogen, 11pathogen were isolated from liver, kidney and surface of diseasedPlecoglossus altiveliswith the NO.from X0901 to X0911.Routine bacterial identification was used to identify this pathogen and the phylogenetic position was investigated using 16S rRNA gene and recA gene sequences analysis.The results of physiological and biochemical tests suggested that they were gram-negative bacteria, and the results of oxidase, contact enzyme, producing indole, arginine decarboxylase, arginine dihydrolase, nitrate reduction tests and MR tests were positive; but they couldn’t generate H2S and the results of V-P test were negative too.Molecular phylogenetic trees of common bacterial were constructed and the results suggested that the pathogen andListonella anguillarumclustered with each other.And the results corresponded with that of routine bacterial identification.The identity of 16S rRNAgene and recA gene between pathogen andListonella anguillarumwere 99.9% and 99.8% respectively.The topology of phylogenetic tree constructed by recA gene was generally agreed with that of 16S rRNA gene.And recA gene was much more discriminatory than 16S rRNA gene.So the conclusion was recA gene was an alternative phylogenetic and identification marker for the common vibrios.

Plecoglossus altivelis; Listonella anguillarum; isolation; identification

P736.22+1

A

1001-6932(2010)01-0084-07

2009-09-22；

2009-11-06

浙江省科技廳科研院所專項公益技術攻關項目 (2007F10009)；浙江省科技廳科研院所青年人才計劃項目 (2006R20001)；溫州市科技興海項目 (S20070051)

王成義 (1984－)，男，在讀碩士，主要病害及遺傳學研究。電子郵箱：sciencew@163.com

陳少波， chenshaobo@hotmail.com