全絲膠蠶品種絲膠蛋白酶的抗氧化能力

　　摘要：本文比較了全絲膠品種蠶繭熱水溶解的全天然絲膠蛋白質與其他非全絲膠品種蠶繭的絲膠蛋白質及其絲膠蛋白酶的抗氧能力。結果表明，絲膠蛋白本身沒有抗氧化能力，不同品種的絲膠蛋白酶的抗氧化能力則各不相同，去除羥基自由基和去超氧自由基的能力，全天然黃綠絲＞全天然白絲＞菁松皓月＞遠緣雜交黃絲＞遠緣雜交白絲。
　　關鍵詞：全絲膠蠶品種　絲膠蛋白酶　抗氧化能力
　　
　　前言：
　　人類生存的環境中充斥著不計其數的自由基，我們無時無刻不暴露在自由基的包圍和攻擊中。炒菜油煙產生大量自由基，吸煙能最直接產生自由基。汽車尾氣、工業生產廢氣等環境污染產生的大量廢氣產生大量自由基。另外，人體自身新陳代謝過程中由于氧化反應也會產生自由基。
　　自由基對人體攻擊的途徑是多方面的，既有來自體內的，也有來自外界的，自由基對人體的攻擊，既在最深層引起突變，又在最表層留下痕跡。自由基引發氧化作用，人體體外發生氧化，光和空氣容易產生活性氧化酶和促進酪氨酸活性化活性，使皮膚發皺、產生斑點、變黑老化、引發皮膚癌變的可能。人體皮膚體內發生氧化，由于活性氧化酶作用，會引起精神緊張、心累、苦痛、寒冷、感染等極其普遍的刺激，而產生生體機能的變化，與癌、動脈硬化、糖尿病等具有密切關系。人類的食品發生氧化，人體本身是產生活性氧化酶和促進酪氨酸活性化活性的好適環境，食品的氧化是酶的褐變和黑色素的積累過程，使食品變質，營養破壞，導致一系列的食品制造、安全保鮮、營養吸收等惡劣后果。各種自由基所引發的氧化作用，是導致身體中各組織和器官損傷、病變的重要原因之一。人的衰老、動脈硬化、心臟病、腫瘤、腎病、肝病、糖尿病、白內障等近百種疾病的發生和發展均與自由基所引發氧化有關。
　　蛋白質抗氧化能力的大小在于去除自由基的能力。因此，降低自由基危害極為重要。降低自由基危害的途徑也有兩條：一是利用內源性自由基清除系統清除體內多余自由基；二是發掘外源性抗氧化劑——自由基清除劑，阻斷自由基對人體的入侵。
　　不同分子量范圍的絲膠蛋白酶具有較強的自由基清除清除作用，非常適合于化妝品護膚品、醫藥保健品等領域的應用。然而，現行利用的絲膠基本上都是從生絲加工時排出的精煉液中回收的，或是從繭殼中用堿水和熱水溶出?；厥仗崛〉慕z膠蛋白容易變性，而且易混入分解物，透析、精制的工藝復雜，生產成本高。
　　日本在世界上首次育成了家蠶絲膠品種，絲膠含量達到98.5％。是直接用于各種絲膠高級化妝、保健等產品的優良材料。本研究組利用日本引進的絲膠品種資源和自主創新品種資源，采用遠緣雜交、基因導入、定向選育等方法，育成“綠s”和“白s”兩個絲膠特殊蠶品種，全天然絲膠蛋白含量達97％以上。本文在利用絲膠特殊蠶品種大量生產優質的全天然純絲膠蛋白質的基礎上，探討絲膠品種生產的全天然絲膠蛋白質及其絲膠蛋白酶的抗氧化能力。
　　
　　一、材料與方法
　　
　　1　材料
　　1.1　蠶繭品種
　　綠S　全天然黃綠色絲膠品種
　　白S　全天然白絲膠品種
　　YZ01　遠緣雜交黃綠色普通品種
　　YZ02　遠緣雜交白色普通品種
　　JS　菁松皓月現行普通品種
　　均由安徽省農業科學院蠶桑研究所提供。
　　
　　2　實驗方法
　　2.1　絲膠溶解
　　稱量供試品種蠶繭各5g，用溫水洗滌去掉贓物，剪成碎片，加入用氫氧化鈉調PH至10.5的溶液250ml，浸泡一小時，加入10g碳酸鈉/100ml，放入滅菌鍋在125℃煮2.5h，用紗布過濾，生絲用溫水洗滌三遍，合并蠶絲脫膠液和洗滌液，然后濾紙抽濾，獲得絲膠溶液。
　　2.2　絲膠溶液濃縮
　　絲膠溶液在80℃旋轉蒸發至約200ml，濃縮液加入400m195％的乙醇，搖勻，在6000r/min分離心10min，棄去上清，留下沉淀。
　　2.3　冷凍真空干燥
　　分別在試管中加入20ml絲膠濃縮液置于離心管中，往其中慢慢滴入0.1mol/l的鹽酸溶液，至溶液中有渾濁，放入在冷凍真空干燥儀在樣品溫度-33℃，壓強1帕斯卡條件下干燥。
　　
　　3　絲膠蛋白酶解物的抗氧化性
　　3.1　抗氧化性實驗原理
　　清除羥基自由基：雙氧水在亞鐵離子的催化下會反應生成羥基自由基，生成羥基自由基過程中，536nm和510nm處有光吸收的中間產物，當加入超氧自由基清除劑時，能迅速與超氧自由基反應，阻止中間產物的積累，致使溶液在320nm處吸收減弱，以水楊酸乙醇溶液作為捕捉劑，生成紫色，在波長510nm和536nm檢測吸光度來評價清除劑對羥基自由基的清除作用。
　　清除超氧自由基(-O2-)：采用鄰苯三酚自氧化法產生超氧自由基，鄰苯三酚在pH＞7.9后迅速自氧化。自氧化過程中形成一系列320nm處有光吸收的中間產物，當加入超氧自由基清除劑時，能迅速與超氧自由基反應，阻止中間產物的積累，致使溶液在320nm處吸收減弱。通過測定吸光度值加值來評價清除劑對超氧自由基的清除作用。
　　3.2　試劑的配制
　　0.05mol/l Tris-HCl緩沖液(pH8.2)：準確稱量Tris：6.057g，加入990mL蒸餾水，混勻，使得Tris溶解，用1mol/1HCI調PH到8.2.
　　水楊酸乙醇溶液：準確稱量水楊酸0.143g，用無水乙醇定容到100ml，搖勻。
　　3.3　去除羥基自由基的實驗方法
　　用FeSO+HO產生-OH，以-OH氧化水楊酸鈉所得產物的吸光值表示OH的多少，吸光值越大，-OH越多。反應試管中加入0.5ml，9mmol/1FeSO、0.5m19mmol/l水楊酸一乙醇及1ml不同濃度的樣品，最后加9mmol/1HO0.5m1啟動反應，37℃溫浴1h，取約0.1g絲膠蛋白溶于水作為樣品溶液，以0.5mL蒸餾水作空白代替待測液作空白試驗，于536nm處測吸光值。
　　清除率(％)=[A3-(A1-A2)]/A3×1400
　　式中：A1為對照不加樣品；
　　A2為某濃度時的吸光值；
　　A3為無顯色劑時的該濃度的本底值。
　　3.4　清除超氧自由基的能力
　　取0.05mol/l Tris-HCl緩沖液(pH=8.2)4ml，置于25℃水浴中預熱20min，分別加入待測液0.5ml和25mmol/l鄰苯三酚溶液0.5ml，混勻后于25℃水浴中反應5min，加入8％的HCl0.2ml終止反應，在320nm處測吸光度，取約0.1g絲膠蛋白溶于水作為樣品溶液，以0.5ml蒸餾水作空白代替待測液作空白試驗，于536nm處測吸光值。
　　清除率(％)=[A3-(A1-A2)]/A3×100
　　式中：A1對照不加樣品；
　　A2底物濃度時的吸光值；
　　A3無顯色劑時的該濃度的本底值。
　　3.5　絲膠蛋白酶解物的抗氧化能力
　　絲膠蛋白酶解在試管中加入0.1g/ml風味酶2ul、0.1g/l絲膠溶液、PH7.0、液溫50℃的條件下進行酶解反應2h后，100℃水煮10min對酶的滅活后對其樣品溶液進行吸光值測定，并計算去除自由基能力。
　　
　　二、結果與分析
　　
　　1　絲膠蛋白本身的去除羥基自由基能力
　　制備1g/1未經過酶解的絲膠蛋白溶液，設置3個重復區，在波長536nm處進行檢測吸光度，按照3.4的方法計算去除羥基自由基能力如表1。
　　
　　從表1可以看出，絲膠蛋白本身的去除羥基自由基的能力很差，幾乎沒有底物濃度的差別，最高的僅為2.469％，幾乎可以認為絲膠蛋白本身沒有抗氧化能力。
　　
　　2　不同蠶繭提取的絲膠蛋白的去除羥基自由基的能力
　　取供試的5種絲膠蛋白，分別制備1g/1經過風味酶解的絲膠酶解物0.1g/1，設置0.02-0.10％的5個不同底物濃度，各3個重復區，在波長536nm處進行檢測去除羥基自由基吸光度，按照3.4的方法計算去除羥基自由基能力，絲膠蛋白濃度作為橫坐標，去除羥基自由基的能力作為縱坐標，得到圖1及圖2。
　　
　　圖1、圖2顯示同樣的趨勢，各種絲膠的去除超氧自由基的能力不同，基本上是全天然黃綠絲＞全天然白絲＞遠緣雜交黃絲＞遠緣雜交白絲＞菁松皓月，隨著蛋白濃度在增加，去除超氧自由基的能力也隨之增加，綠s的去除超氧自由基能力最高可達到25％以上，白S的去除超氧自由基能力也可達到20％以上。菁松皓月僅在7％左右。
　　
　　3　不同品種絲膠蛋白酶解物的去除超氧自由基的能力
　　取供試的5種絲膠蛋白，分別制備1g/1經過風味酶解的絲膠酶解物，設置0.02-0.10％的5個不同底物濃度，各3個重復區，在波長320nm處進行檢測去除超氧自由基的吸光度，并且計算去除羥基自由基能力，絲膠蛋白濃度作為橫坐標，去除羥基自由基的能力作為縱坐標，得到圖3。
　　
　　和圖1、圖2實驗結果相近，各種絲膠的去除超氧自由基的能力不同，基本上是全天然黃綠絲＞全天然白絲＞遠緣雜交黃絲＞遠緣雜交白絲＞菁松皓月，隨著蛋白濃度在增加，去除超氧自由基的能力也隨之增加，綠S的去除超氧自由基能力最高可達到40％以上，白S的去除超氧自由基能力也可達到25％以上。菁松皓月僅在7％左右。
　　
　　三、討論
　　
　　1　絲膠蛋白本身沒有抗氧化能力，但經過酶解后的絲膠多肽具有較強的抗氧化性能力。
　　而“綠S”蛋白質的酶解物消除自由基的能力遠比其他品種絲膠強，其主要原因是“綠S”絲膠蛋白質中的含有較多具有抗氧化、消除自由基的能力黃酮素。
　　2　隨著絲膠蛋白的增加。也就是底物濃度的增加，在酶的催化下水解，產生的具有去除超氧自由基的多肽的量就比較多，所表現的去除超氧自由基的能力就比較強，如果底物濃度再提高，相信去除自由基的效果會更明顯，但需要試驗結果加以證實。
　　3　絲膠蛋白只有在酶解成多肽過程中才具有去除自由基的能力的結果，驗證了山崎等絲膠蛋白本身幾乎不具有抗氧化作用的結論，驗證了加藤的絲膠水解物具有較強抗氧化作用的結論，使兩位學者的觀點得到統一。
　　4　利用品種生產全天然純絲膠蛋白質是研究和開發天然抗氧化劑在化妝品、保健食品、生物領域的應用具有重要意義。
　　
　　編輯　田